Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays
Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt (CRISPR) CRISPR-Cas9-basierte Methode für eine einfache und rasche Untersuchung der Rolle der mehrere Kandidaten-Gene in der akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellproliferation in Parallel. Diese Technik ist skalierbar und kann in anderen Krebszelllinien angewendet werden.
Abstract
Gen Störung Studien sind weitgehend benutzt worden, um die Rolle einzelner Gene in AML-Pathogenese zu untersuchen. Für das komplette gen Störung erreichen, haben viele dieser Studien gemacht komplexe gen Knockout Modelle verwenden. Während dieser Studien mit Knockout-Mäusen eine elegante und bewährte System zur Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehung bieten, eine schnelle und skalierbare Methode zur Bewertung von Kandidatengenen, die spielen eine Rolle bei der AML Zellproliferation oder Überleben in AML Modelle hilft die parallele Abfrage des mehrere Kandidaten-Gene zu beschleunigen. Jüngste Fortschritte in der Genom-Bearbeitung Technologien haben unsere Leistungsfähigkeit genetische Störungen in nie gekanntem Ausmaß dramatisch verbessert. Ein solches System der Genom-Bearbeitung ist die CRISPR-Cas9-basierte Methode, die rasche und wirksame Änderungen im Genom Ziel-Zelle verwendet werden kann. Die Einfachheit und Skalierbarkeit der CRISPR/Cas9-vermittelte gen-Löschung macht es eine der attraktivsten Techniken für die Befragung einer Vielzahl von Genen in phänotypische Tests. Hier stellen wir einen einfache Assay mit CRISPR/Cas9 vermittelte gen-Störung kombiniert mit Hochdurchsatz-Flow-Zytometrie-based Wettbewerb Assays, um die Rolle der Gene, die eine wichtige Rolle bei der Verbreitung spielen kann oder das Überleben der Menschen zu untersuchen und murine AML-Zell-Linien.
Introduction
Die letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forschungsanstrengungen konzentriert sich auf die Ermittlung des Beitrags der wichtigsten molekularen Signalwege in der Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) gesehen. Traditionell wurde gen-Störung in AML Zellen mit bedingter Knockout-Mäusen oder kurze Haarnadel RNA (ShRNA) durchgeführt. Knockout-Mäusen bieten ein ausgeklügeltes System für die räumlich-zeitliche Steuerung von gen-Löschung, ist Generierung von gen-Knockout-Mäusen arbeitsintensiv, zeitaufwändig und teuer. Darüber hinaus gen-Knockouts mit Rekombination Strategien ist nicht leicht skalierbar; Diese Strategien eignen nicht sich gut für die Befragung mehrerer Gene parallel. Nach der Entdeckung der RNA Interferenz-Methoden, um Knock-down endogenen mRNAs mit kleinen interferierende RNA (SiRNA) oder ShRNA begannen viele Gruppen mit RNA Interferenz Techniken, um die Rolle bestimmter Gene in AML zu untersuchen. Da murine und menschlichen AML-Zellen sind notorisch schwierig zu transfizieren, mit traditionellen Lipid-basierte Transfektion Methoden, die meisten Studien angestellt lentivirally oder retrovirally-codierte ShRNA für Genfunktion in AML Zellen zu studieren. Die jüngste Entdeckung der gruppierten regelmäßig dazwischen kurzer palindromische Wiederholungen (CRISPR) und die zugehörigen Cas Nukleasen (CRISPR-Cas9) hat gen-targeting Technologien1,2,3revolutioniert. CRISPR-Cas9 verwenden, können bestimmte Gene oder genomische Regionen gelöscht, bearbeitet oder mit dem Stichwort Effizienz und Benutzerfreundlichkeit. CRISPR-Cas9-basierte gen-Bearbeitung taucht nun als die Methode der Wahl für die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in unterschiedlichen Zelltypen aufgrund der Einfachheit, die Wirksamkeit und die breite Anwendbarkeit dieser Technik. CRISPR-Cas9-basierte Methoden sind auch immer die Methode der Wahl in AML, nicht nur für Abfragen einzelner Gene, sondern auch als eine Möglichkeit, mehrere Gene in angeordneten oder zusammengefasste genetische Schirme Ziel angestrebt untersucht mehrere Gene parallel als Potenzial AML-Abhängigkeiten4,5,6.
In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Konkurrenzfähigkeit Test zur Messung der Auswirkungen von gen-Störung auf das Wachstum der AML Zellen, basierend auf stabile CRISPR-Cas9-vermittelten gen-Bearbeitung gefolgt von Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie. Diese Methode ist einfach, effizient und skalierbar bis Medium-Durchsatz Experimente zur Untersuchung der Rolle von mehreren Genen in AML Zellen parallel.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines CRISPR-Cas9-basierte Konkurrenzfähigkeit Assays untersucht die Rolle von Kandidatengenen in AML Zelllinien mit Flow-Zytometrie in Human/Murine AML Zellen (Abbildung 5). Das Ziel des Tests ist die Wirkung des Gens Löschung auf Wartung der AML Zellproliferation über zwei bis drei Wochen im Maßstab des Medium-Durchsatz zu identifizieren. Einige wichtige Schritte müssen sorgfältig befolgt werden, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das pCW-Cas9-Plasmid war ein Geschenk von Eric Lander & David Sabatini (Addgene Plasmid # 50661) und die pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – W-Plasmid aus dem Labor Yusa (Addgene Plasmid #67974. Wir möchten die Durchflusszytometrie Kern bei SBP Medical Discovery Institute für rechtzeitige Hilfe mit Flow-Analyse und Sortierung zu danken. Wir würden gerne die Unterstützung der Lady Tata Memorial Foundation n. anerkennen Wir möchten auch die Unterstützung der folgenden Finanzierungsquellen anerkennen: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center gesponsert Grant, der V-Stiftung und der San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
Referências
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