Indagine delle dipendenze genetiche utilizzando dosaggi di concorrenza basati su CRISPR-Cas9
Summary
Questo manoscritto descrive un cluster regolarmente intervallate breve palindromo si ripete (CRISPR) CRISPR Cas9 metodo basato per indagine semplice e rapida del ruolo di geni candidati multipli nella proliferazione delle cellule di leucemia mieloide acuta (LMA) in parallelo. Questa tecnica è scalabile e può essere applicata in altre linee cellulari di cancro pure.
Abstract
Gene perturbazione studi sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo dei singoli geni nella patogenesi AML. Per la realizzazione completa del gene, molti di questi studi hanno fatto ricorso a modelli di knockout del gene complesso. Mentre questi studi con topi knockout offrono un sistema elegante e time-tested per indagare le relazioni genotipo-fenotipo, un metodo veloce e scalabile per la valutazione di geni candidati che gioca un ruolo nella proliferazione delle cellule AML o sopravvivenza nei modelli AML aiuterà ad accelerare l’interrogatorio parallela di più geni candidati. I recenti progressi nelle tecnologie di modifica del genoma hanno drammaticamente migliorato la nostra capacità di eseguire perturbazioni genetiche in una scala senza precedenti. Uno di questi sistemi di editing genomico è il metodo di CRISPR-Cas9-based che può essere utilizzato per apportare modifiche rapide ed efficaci nel genoma della cellula bersaglio. La facilità e la scalabilità di omissione del gene per CRISPR/Cas9-mediata rende una delle tecniche più attraente per l’interrogatorio di un gran numero di geni nelle analisi fenotipiche. Qui, presentiamo un’analisi semplice utilizzando rottura CRISPR/Cas9 mediato del gene combinata con saggi di alto-rendimento flusso cytometry-concorrenza basata per indagare il ruolo dei geni che possono svolgere un ruolo importante nella proliferazione o la sopravvivenza dell’essere umano e murine linee cellulari AML.
Introduction
Degli ultimi decenni hanno visto numerosi sforzi di ricerca focalizzati sull’identificazione il contributo dei principali meccanismi molecolari nella patogenesi della leucemia mieloide acuta (AML). Tradizionalmente, rottura del gene in cellule di AML è stata eseguita utilizzando topi knock-out condizionale o short hairpin RNA (shRNA). Mentre i topi knockout offrono un sofisticato sistema per il controllo spazio-temporale di omissione del gene, generazione di topi knockout del gene è laborioso, lungo e costoso. Inoltre, gene-Ko utilizzando strategie di ricombinazione non è facilmente scalabile; Queste strategie non si prestano bene per l’interrogatorio di parecchi geni in parallelo. Dopo la scoperta di metodi di interferenza del RNA di colpo mRNAs endogeno utilizzando piccolo RNA interferente (siRNA) o shRNA, molti gruppi iniziato utilizzando tecniche di interferenza del RNA per indagare il ruolo dei geni specifici in AML. Poiché le cellule AML sia murine ed umane sono notoriamente difficili a transfect utilizzando metodi di trasfezione basata sui lipidi tradizionali, la maggior parte studia lentivirally autonomo o con codifica retrovirally shRNA per lo studio della funzione del gene in cellule di AML. La recente scoperta di cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) e l’associato nucleasi Cas (CRISPR-Cas9) ha rivoluzionato la gene-targeting tecnologie1,2,3. Utilizzando CRISPR-Cas9, specifici geni o regioni genomiche possono essere eliminate, modificate o taggate con efficienza e semplicità. CRISPR Cas9-editing basato su gene ora sta emergendo come il metodo di scelta per indagare le relazioni genotipo-fenotipo in tipi cellulari diversi a causa della semplicità, efficacia e ampia applicabilità di questa tecnica. Metodi basati su CRISPR-Cas9 stanno diventando il metodo di scelta in AML, non solo per interrogare i singoli geni, ma anche come un modo di indirizzare i geni multipli in disposti o pooled schermi genetici finalizzati ad indagare diversi geni in parallelo come potenziale AML-dipendenze4,5,6.
In questo manoscritto, descriviamo un’analisi semplice crescita competitiva per misurare l’impatto della rottura del gene sulla crescita delle cellule di AML, basato sulla stabile CRISPR-Cas9-mediated gene-modifica seguita da citometria a flusso ad alta velocità. Questo metodo è semplice, efficiente e scalabile per esperimenti di media-velocità di trasmissione per investigare il ruolo di parecchi geni in parallelo in cellule AML.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, descriviamo un protocollo dettagliato per lo svolgimento di un’analisi di crescita competitiva basati su CRISPR-Cas9 per studiare il ruolo di geni candidati in linee cellulari AML mediante citometria a flusso in cellule di AML umano/murino (Figura 5). L’obiettivo del test è di identificare l’effetto della delezione del gene sulla manutenzione di proliferazione delle cellule AML oltre due o tre settimane su scala medio-velocità di trasmissione. Alcuni passaggi critici…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il plasmide pCW-Cas9 era un regalo da Eric Lander & David Sabatini (plasmide Addgene # 50661) e il pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – plasmide W dal laboratorio Yusa (plasmide Addgene #67974. Vorremmo ringraziare il nucleo di citometria a flusso a SBP Medical Discovery Institute per il tempestivo aiuto con l’analisi di flusso e l’ordinamento. Vorremmo riconoscere il sostegno di Lady Tata Memorial Foundation a A.D. Vorremmo anche riconoscere il sostegno delle seguenti fonti di finanziamento: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsorizzato Grant, la V-Fondazione e i centri di cancro NCI (C3) di San Diego #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
Referências
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
