Investigación de las dependencias genéticas usando análisis CRISPR Cas9 basado en competencia
Summary
Este manuscrito describe un método de CRISPR Cas9 basado en cluster regularmente otro corto palindrómico repite (CRISPR) simple y expedita investigación del papel de varios genes candidatos en la proliferación de células de leucemia mieloide aguda (AML) en paralelo. Esta técnica es escalable y puede ser aplicada en otras líneas celulares de cáncer así.
Abstract
Estudios de perturbación del gene se han utilizado para investigar el papel de los genes individuales en la patogenesia de la AML. Para lograr la interrupción del gen completo, muchos de estos estudios han hecho uso de modelos de complejos gene knockout. Si bien estos estudios con ratones knockout ofrecen un sistema elegante y comprobado para investigar relaciones genotipo a fenotipo, un método rápido y escalable para la evaluación de genes candidatos que juegan un papel en la proliferación de células AML o supervivencia en modelos AML le ayudará a acelerar el interrogatorio paralelo de múltiples genes candidatos. Los avances recientes en tecnologías de la edición del genoma han mejorado considerablemente nuestra capacidad para llevar a cabo las perturbaciones genéticas en una escala sin precedentes. Tal sistema de la edición del genoma es el método basado en el Cas9 CRISPR que puede utilizarse para hacer rápidas y eficaces alteraciones en el genoma de la célula blanco. La facilidad y la escalabilidad de la canceladura del gene CRISPR/Cas9-mediada, es una de las técnicas más atractivas para el interrogatorio de un gran número de genes en los ensayos fenotípicos. Aquí, presentamos un ensayo simple utilizando CRISPR/Cas9 mediada gen-interrupción combinada con ensayos de alto rendimiento basado en la citometría de flujo competencia para investigar el papel de los genes que pueden desempeñar un papel importante en la proliferación o la supervivencia del ser humano y líneas celulares de ratón AML.
Introduction
Las últimas décadas han visto numerosos esfuerzos de investigación se centró en la identificación de la contribución de principales vías moleculares en la patogenia de la leucemia mieloide aguda (AML). Tradicionalmente, interrupción de genes en las células de la AML se ha realizado con ratones knockout condicional o short hairpin RNA (shRNA). Mientras que los ratones knockout ofrecen un sofisticado sistema de control espacio-temporal de la canceladura del gene, generación de ratones knockout de genes es mano de obra intensiva, desperdiciador de tiempo y costoso. Por otra parte, gene knockouts utilizando estrategias de recombinación no es fácilmente escalable; Estas estrategias no se prestan bien al interrogatorio de varios genes en paralelo. Tras el descubrimiento de métodos de interferencia RNA mRNAs endógena de precipitación mediante ARN interferente pequeño (siRNA) o shRNA, muchos grupos comenzaron a utilizar técnicas de interferencia de RNA para investigar el papel de genes específicos en AML. Desde murinas y humanas células AML son notoriamente difíciles de transfectar utilizando métodos tradicionales de base de lípidos la transfección, la mayoría estudios shRNA empleada lentivirally o retrovirally codificadas para el estudio de funciones de los genes en las células de la AML. El reciente descubrimiento de agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y las nucleasas Cas asociadas (CRISPR-Cas9) ha revolucionado gene targeting tecnologías1,2,3. Usando CRISPR Cas9, determinados genes o regiones genómicas pueden ser eliminadas, editadas o etiquetadas con eficacia y facilidad. Basado en el Cas9 CRISPR gene-edición surge ahora como el método de elección para investigar la relación genotipo-fenotipo en tipos de células diferentes debido a la simplicidad, eficacia y amplia aplicabilidad de esta técnica. También se están convirtiendo CRISPR Cas9-métodos basados en el método de elección en la AML, no sólo para interrogar a los genes individuales, sino también como una manera de objetivo de múltiples genes en pantallas genéticas vestidas o combinados destinado a investigar varios genes en paralelo como potencial AML-dependencias4,5,6.
En este manuscrito, describimos un análisis simple crecimiento competitivo para la medición del impacto de la gene-interrupción en el crecimiento de las células de la AML, basado en estable mediada por Cas9 CRISPR gene-edición seguida por citometría de flujo de alto rendimiento. Este método es simple, eficiente y escalable a medio rendimiento experimentos para investigar el papel de varios genes en paralelo en las células de la AML.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, se describe un protocolo detallado para llevar a cabo un ensayo de crecimiento competitivo basado en el Cas9 CRISPR para investigar el papel de genes candidatos en líneas de células de la AML mediante citometría de flujo en células AML de humano/murino (figura 5). El objetivo del análisis es identificar el efecto de la canceladura del gene en el mantenimiento de la proliferación de células AML durante dos a tres semanas en una escala de rendimiento medio. Algunos p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El plásmido pCW Cas9 fue un regalo de Eric Lander & David Sabatini (plásmido Addgene # 50661) y pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – plásmido W del laboratorio Yusa (plásmido Addgene #67974. Nos gustaría agradecer al núcleo de la citometría de flujo en Pas Medical Discovery Institute por oportuna ayuda con análisis de flujo y clasificación. Nos gustaría agradecer el apoyo de la Fundación Señora Tata Memorial a A.D. Nos gustaría también agradecer el apoyo de las siguientes fuentes de financiamientos: NIH/NCI P30 CA030199 cáncer centro patrocinado por donación, la Fundación de la V y los centros de cáncer del NCI de San Diego (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
Referências
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