Alta velocità effettiva In Vitro valutazione della latenza inversione agenti sulla trascrizione di HIV e Splicing
Summary
Un protocollo di throughput elevato per la valutazione funzionale di riattivazione efficiente HIV e clearance del provirus latenti è descritto e applicato dalla prova dell’impatto di interventi sulla trascrizione di HIV e di splicing. Risultati rappresentativi dell’effetto di latenza inversione agenti sulla trascrizione LTR-driven e splicing sono forniti.
Abstract
L’HIV rimane incurabile a causa dell’esistenza di un serbatoio di cellule che nutre forma stabile e latente del virus, che rimane invisibile al sistema immunitario e non è mirato dall’attuale terapia antiretrovirale (cART). Trascrizione e splicing sono stati indicati per rafforzare la latenza di HIV-1 nelle cellule T CD4 + di riposo. Inversione di latenza mediante l’uso di agenti di inversione di latenza (LRA) nell’approccio “shock and kill” è stata studiata estesamente nel tentativo di eliminare questo serbatoio ma finora non ha dimostrato alcun successo negli studi clinici a causa della mancanza di sviluppo di piccoli adeguato molecole che possono perturbare in modo efficiente questo serbatoio. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo per attendibilmente ed efficientemente valutare gli agenti di inversione di latenza (LRA) sulla trascrizione di HIV e giunzione. Questo approccio si basa sull’uso di un reporter di doppio colore LTR-driven che consente di misurare contemporaneamente l’effetto di un LRA sulla trascrizione e splicing tramite flusso cytometry. Il protocollo descritto qui è adeguato per le celle aderenti, come pure le cellule in sospensione. È utile per il testing di un gran numero di farmaci in un sistema di alta velocità di trasmissione. Il metodo è tecnicamente semplice da implementare ed economicamente vantaggiosa. Inoltre, l’uso di citometria a flusso permette la valutazione di attuabilità delle cellule e così droga tossicità allo stesso tempo.
Introduction
Nonostante la terapia antiretrovirale a lungo termine efficace HIV persiste in uno stato latente come un provirus integrato in memoria di cellule T CD4 +1. La struttura della cromatina del HIV-1 5′ promotore di ripetizione terminale lunga (litro) e modificazioni epigenetiche come metilazione dell’istone e deacetilazione di methyltransferases del DNA (DNMT) e istone deacetilasi (HDAC) sono importanti meccanismi che conducono alla repressione trascrizionale e così post-integrazione latenza2,3. Una grande varietà di agenti inversione di latenza (LRA) è stata studiata per la loro efficacia per indurre la produzione di virus in vitro e in vivo da latente infettati riposo T CD4 + cellule4,5,6,7 ,8. Tra gli enti locali e regionali testato, HDACi (inibitori HDAC) e scommessa bromodomain inibitori (BETis) inducono decondensazione della cromatina e rilascio della trascrizione positivo allungamento fattore b (P-TEFb) rispettivamente, che porta a successive alleviare il trascrizionale repressione a 5′ LTR e attivazione di HIV espressione9,10,11,12,13. Tuttavia, la grandezza della riattivazione raggiunta da questi enti era limitata, come è stato osservato solo un modesto aumento associato unspliced HIV mRNA (RNA noi), indicativo della trascrizione virale, ex vivo14,15. D’importanza, questi enti anche non è riuscito a indurre una riduzione della frequenza delle cellule latente infettate.
L’espressione di HIV può essere ulteriormente limitata da splicing inefficiente16 , nonché i difetti in export nucleare di moltiplicare impiombato HIV RNA (RNA MS)17. Così, sono necessari identificazione nuove classi di enti locali e regionali che sono più potenti e possono interessare diversi aspetti di post-integrazione produzione del virus. Inoltre, lo sviluppo di nuovi saggi che aiutano a definire i composti ottimali per invertire in modo efficiente la latenza è richiesto.
Qui, un protocollo è presentato, che utilizza un approccio ad alta produttività per la valutazione funzionale dell’impatto degli interventi su trascrizionale LTR di HIV e splicing. In breve, un nuovo dual LTR-driven colore reporter sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figura 1) viene utilizzato per valutare la riattivazione di HIV tramite flusso cytometry. In questo reporter fluorescente, l’espressione del mRNA di unspliced HIV (4 kb) conduce all’espressione migliorata della proteina fluorescente verde (EGFP), mentre l’espressione di mRNA splicing (2Kb) porterebbe all’espressione della proteina fluorescente di Discosoma sp. rosso (DsRed). In breve, abbiamo usato una proteina di fusione di Env-EGFP fluorescente, gp140unc. EGFP, dove la sequenza codificante di EGFP è stata posizionata nel telaio con una forma non-spaccata e troncata della busta (Env). Le modifiche sono state introdotte per l’ablazione del sito di clivaggio impedendo la dissociazione di Env in gp120 e gp41-EGFP e troncare la proteina gp160 prima il dominio transmembrana creando un analogo solubile di Env, che facilita la piegatura corretta e espressione di EGFP. Al momento l’espressione all’interno di una cella, Rev si localizza nel nucleo dove media l’esportazione nucleare-citoplasmico di 4KB env mRNA tramite l’interazione con l’elemento sensibile rev (RRE). Il troncamento di Env non compromette la RRE, che si trova tra gp120, gp41 e A7 3′ luogo della giuntura. In questo sistema, splicing a HIV-1 splice donatore 4 (SD4) e della giuntura acceptor 7 (SA7) risultati nella produzione di un 2 kb mRNA che codifica per una proteina non funzionale di Rev troncata all’amminoacido 38 fusa alla proteina fluorescente di DsRed, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed è stato inserito in essone 2nd di Rev all’amminoacido 38 da sovrapposizione estensione18. Per facilitare l’esportazione nucleare di unspliced mRNA, un vettore di espressione mammifera codifica Rev (pCMV-RevNL4.3) è stato co-trasfettato con la costruzione del reporter fluorescenti (Figura 2). Questo costrutto unico reporter qui descritto è utile nella valutazione di alto-rendimento di trascrizione di HIV e intestature, senza la necessità di utilizzare vettori virali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Data la difficoltà nel misurare la riattivazione del virus ex vivo, una vasta gamma di in vitro sono stati sviluppati modelli nel tempo al fine di studiare la latenza di HIV tra cui latente infettato linee a cellula T (J-Lats, ACH2, U1), modelli primari dell’infezione latente di riposo ( Modelli o ‘ Doherty, Lewin, Greene e Spina) o pre-attivato le cellule T CD4 + (Serafini, Marini, Planelles, Siliciano, modelli di Karn) con singolo turno o replica competente reporter virus22. Per modellare le co…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal progetto grant APP1129320 e programma grant APP1052979 da NHMRC dell’Australia. Ringraziamo Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson e Michelle Y. Lee per la fornitura di costrutti essenziali e consigli per il corretto completamento di questo lavoro. Ringraziamo anche il personale della struttura di flusso di DMI per i loro consigli e la generosa assistenza nel mantenere il citometro a flusso utilizzato in questo studio.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
Referências
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure – The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency – reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
