Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda
Summary
Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.
Abstract
HIV permanece incurável devido à existência de um reservatório de células que abriga o formulário estável e latente do vírus, que permanece invisível para o sistema imunológico e destina-se não pela atual terapia anti-retroviral (carrinho). Transcrição e emendando foram mostrados para reforçar a latência do HIV-1 em células T CD4 + a descansar. Reversão de latência pelo uso de agentes de reversão de latência (órgãos) na abordagem de “choque e matar” tem sido estudado extensivamente na tentativa de purgar este reservatório, mas até agora não mostrou qualquer sucesso em ensaios clínicos, devido à falta de desenvolvimento de pequenas adequada moléculas que podem eficientemente a perturbar este reservatório. O protocolo apresentado aqui fornece um método para confiável e eficiente avaliação de agentes de reversão de latência (órgãos) na transcrição de HIV e de emenda. Esta abordagem baseia-se na utilização de um repórter de cor dupla LTR-driven que simultaneamente pode medir o efeito de um LRA na transcrição e emenda por citometria de fluxo. O protocolo descrito aqui é adequado para as células aderentes, bem como as células em suspensão. É útil para testar um grande número de drogas em um sistema de alta taxa de transferência. O método é tecnicamente simples de implementar e cost-effective. Além disso, o uso da citometria de fluxo permite a avaliação da viabilidade celular e, portanto, toxicidade de drogas ao mesmo tempo.
Introduction
Apesar da terapia de antiretroviral eficaz a longo prazo, HIV persiste em estado latente, como um provirus integrado em memória de células T CD4 +1. A estrutura da cromatina do HIV-1 5′ promotor de repetição tempo terminal (LTR) e modificações epigenéticas como metilação de histonas e deacetilação de histona por DNA metiltransferases (DNMT) e histona deacetilases (HDAC) são mecanismos importantes, levando a repressão transcriptional e, assim, a latência de pós-integração2,3. Uma grande variedade de agentes de inversão de latência (órgãos) foi investigada por sua eficácia induzir a produção de vírus in vitro e in vivo de Latentemente infectadas descanso T CD4 + células4,5,6,7 ,8. Entre os órgãos testados, HDACi (inibidores HDAC) e aposta contem inibidores (BETis) induzem ocorre descondensação da cromatina e lançamento da transcrição positivo alongamento fator b (P-TEFb), respectivamente, levando a subsequente aliviar do transcriptional repressão em 5′ LTR e ativação de HIV expressão9,10,11,12,13. No entanto, a magnitude da reativação alcançada por esses órgãos foi limitada apenas um aumento modesto na célula associada unspliced HIV mRNA (RNA nos), indicativo de transcrição viral, observou-se ex vivo14,15. Importante, estes órgãos também conseguiram induzir uma redução da frequência de células Latentemente infectadas.
Expressão de HIV pode ser ainda mais restrito por ineficiente emenda16 , bem como defeitos de exportação nuclear de multiplicar emendados HIV RNA (RNA MS)17. Assim, identificando novas classes de órgãos que são mais potentes e podem afetar aspectos distintos da vírus produção pós integração são necessários. Além disso, o desenvolvimento de novos ensaios que ajudam a definir os compostos ideais para eficientemente reverter a latência é necessário.
Aqui, é apresentado um protocolo, que utiliza uma abordagem de alto rendimento para avaliação funcional do impacto das intervenções na transcrição orientada por HIV LTR e emenda. Em breve, um novo dual LTR-driven cor repórter sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figura 1) é usado para avaliar a reativação de HIV por citometria de fluxo. Este repórter fluorescente, a expressão do mRNA de HIV unspliced (4kb) leva à expressão da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), enquanto a expressão do mRNA emendados (2KB) levaria a expressão de proteínas fluorescentes de Discosoma SP. vermelho (DsRed). Brevemente, usamos uma proteína fluorescente de fusão Env-EGFP, gp140unc. EGFP, onde a sequência de codificação da EGFP foi colocada no quadro com um formulário truncado e un-entalhado do envelope (Env). As alterações foram introduzidas para ablate o local de clivagem, impedindo a dissociação do Env em gp120 e gp41-EGFP e truncar a proteína gp160 antes do domínio transmembrana criando um análogo solúvel de Env, que facilita o correto dobramento e expressão de EGFP. Sobre a expressão dentro de uma célula, Rev localiza-se no núcleo, onde ele Medeia a exportação nuclear citoplasmática de 4KB env mRNA através da interação com o elemento responsivo rev (RRE). Truncamento de Env não compromete a RRE, que se situa entre gp120 e gp41, A7 3′ site da tala. Neste sistema, emendando a HIV-1 splice doador 4 (SD4) e splice aceitador 7 (AE7) resultados na produção de um 2KB mRNA codificação de uma proteína não-funcional de Rev truncada no aminoácido 38 fundido a DsRed proteína fluorescente, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed foi inserido o exon 2nd de Rev no aminoácido 38 por sobreposição extensão18. Para facilitar a exportação nuclear de unspliced mRNA, um vetor de expressão mamíferos codificação Rev (pCMV-RevNL4.3) foi co transfected com construção de repórter fluorescente (Figura 2). Essa construção único repórter descrita aqui é útil na avaliação da elevado-produção de HIV transcrição e emenda, sem a necessidade de usar vetores virais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dada a dificuldade em medir a reativação do vírus ex vivo, uma vasta gama de em vitro modelos foram desenvolvidos ao longo do tempo, a fim de estudar a latência de HIV incluindo Latentemente infectadas T cell-linhas (J-Lats, ACH2, U1), modelos primários de infecção latente de descansar ( O ‘ Doherty, Lewin, Greene e Spina modelos) ou pré-activated células T CD4 + (Santos, Marini, Planelles Siliciano, Karn modelos) com a única rodada ou replicação competente repórter vírus22. Para mod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão do projeto APP1129320 e programa grant APP1052979 do NHMRC da Austrália. Agradecemos o Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson e Michelle Y. Lee para fornecer construções essenciais e conselhos para a conclusão deste trabalho. Agradecemos também a equipe DMI fluxo instalações para seus conselhos e ajuda na manutenção do citômetro de fluxo utilizado neste estudo.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
Referências
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