여기 우리는 큰 규모에 높은 감도 가진 평형에서 및 솔루션에서 바인딩 선호도 결정 하기 위한 새로운 방법을 제시. 이 녹음 방송 요인 DNA 바인딩의 정량 분석을 향상 시킵니다. 메서드를 사용 하면 제어 전달 시스템에 자동화 된 형광 이방성 측정을 기반으로 합니다.
녹음 방송 요인 (TF)의 정확한 정량화-DNA 상호 작용은 유전자 발현의 규칙을 이해 하기 위한 필수적입니다. 때문에 기존 접근 중요 한 한계에서 고통, 큰 규모에 높은 감도와 TF DNA 바인딩 선호도 결정 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 분석 결과 기존된 형광 이방성 (FA) 원칙에 의존 하지만 소개 하는 중요 한 기술 개선. 첫째, 우리는 TF와 붙일 레이블된 참조 다공성 agarose 젤 매트릭스에 DNA 통합 하 여 단일 잘에서 전체 FA 경쟁 적정 곡선을 측정 합니다. 레이블이 없는 DNA 올리고 머 경쟁자로 상단에 로드 되 고, 확산을 통해 spatio 시간적 그라디언트를 형성 한다. 결과 FA 그라디언트는 다음 사용자 지정된 epifluorescence 현미경 설치를 사용 하 여 밖으로 읽기. 이 향상 된 설치는 매우 약하고 강한 바인딩을 비슷한 분자 무게의 분자에도 안정적으로 측정할 수 있도록 FA 신호 검출의 감도 증가 한다. 이 패션에서 우리 다 잘 플레이트의 당 한 적정 곡선을 측정할 수 있는 고 피팅 절차를 통해 우리는 절대 분리 상수 (KD) 및 활성 단백질 농도 추출할 수 있습니다. 바인딩 순서 주어진된 일치의 모든 단일-지점 돌연변이 이체를 테스트 하 여 일반적으로 단일 플레이트에 TF의 전체 바인딩 특이성 풍경 조사 수 우리. 결과 위치 무게 행렬 (Pwm) TF 인 비보에 예측에 다른 방법에서 파생 된 그 뛰어나다. 여기, 우리는 기존의 자동된 형광 현미경과 데이터 분석 파이프라인에 엉덩이-FA를 구현 하기 위한 상세한 가이드를 제시.
유전자 규칙, 양적 방법으로 그들의 바인딩 기본은 파라마운트 중요성의 결정에서 녹음 방송 요인 (TFs)의 중심 역할을 주어. RNA 중 합 효소는 발기인을 모집의 다운스트림 이벤트에 의해 제어 됩니다 동안 그들의 바인딩 열역학 평형에 의해 잘 설명 된 폰 Hippel 정액 연구 규제 TFs 빠르게 DNA를 인식 하는 개념을 도입 느린 속도1. 최근 vivo에서 바인딩 연구 제안이 그림은 가능성이 더 복잡 한2,3; 그럼에도 불구 하 고, 이러한 일반적인 가정 좋은 근사 역할 하 고 cis 규정 요소를 찾아서 시퀀스4,,56식 예측 많은 전산 접근을 지원 했습니다. 평형 바인딩 따라서 성공적으로 개념으로 고용 되어, 현재 메서드를 TF DNA 상호 작용 특이성을 바인딩에 집중 하 고 일반적으로 하지 않습니다 직접 측정 평형에 바인딩 친 화력. TF-DNA 바인딩의 체계적인 측정 상당한 기술적 도전, 나타내고 기존의 방법 여러 가지 한계를가지고.
Chromatin immunoprecipitation 딥 시퀀싱 (칩 seq)7, 가장 널리 퍼진 vivo에서 기술, 다음 바인딩 선호도의 측정 또는 바인딩 게놈 조각 내 사이트의 정확한 지 방화를 허용 하지 않습니다. 여러 생체 외에서 포함 하 여 방법 DNase 프린팅8, 전기 이동 기동성 교대 (EMSA)9, 표면 플라스몬 공명 (SPR)10및 눈금 thermophoresis11 바인딩 선호도 측정할 수 있습니다. 하지만 그들은 상대적으로 낮은 처리량. 반대로, 높은 처리량 기술로 단백질 바인딩 microarrays12, HT SELEX13,14, 세균 한 하이브리드 (B1H)15 바인딩 선호도 측정 하 고 일반적으로 지나치게 얻을 수 없습니다. 특정 바인딩 시퀀스는 주로 엄격한 선택 하거나 필요한 단계를 세척 합니다. 최근 개발 포함 기반으로 딥 시퀀싱 안타-플립16, SELEX seq17그리고 마이크로 기반 MITOMI18 또는 미소-Seq19절대 바인딩 선호도;의 추출에 대 한 허용 그러나, 그들은 레이블 TF와 DNA의 형광 강도 측정에 의존. 형광 신호, 따라서 될 낮은 단백질 농도 및 낮은 KD 값 결정에 제한 (< ~ 10 nM). 또한, 이러한 방법에 TF DNA 바인딩이 일어난다 얇은 표면에 난다 바인딩 또는 자동 형광 배경, 약한 바인딩을 정확 하 게 계량 하기 어려운 문제를 제기.
이러한 한계를 해결 하기 위해 TF DNA 선호도 풍경, 솔루션, 우리 라는 고성능 형광 이방성 (엉덩이-FA)20평형에서 결정 하는 새로운 방법을 개발 했습니다. 기술은21 설립된 형광 이방성 (FA) 분석 결과 기반 하지만 높은 감도 대규모 사용 하 여 사용자 지정된 자동된 현미경 및 분석 설정에 바인딩 상수를 측정 하도록 수정.
FA 분석 결과 레이블이 분자의 분자 회전을 측정 하 여 바인딩 파트너, TF,이 경우에 게 붙일 레이블된 종 (같은 DNA 올리고 머)의 상호 작용을 모니터링 합니다. TF에 바인딩 시 회전 속도 높은 유체역학 반경 및 분자량 증가 FA에서 바인딩된 복합물의 감소. 매우 강한 바인딩의 정확한 측정 (KD < ~ 1 nM) 레이블된, 참조 DNA의 낮은 농도 사용 해야 합니다 (c < ~ 1 nM). 이것은 표준 microplate 리더 등 상업 악기와 함께 달성 하기 어렵습니다. 또한, 바운드 및 언바운드 단지 사이의 큰 크기 차이 (10-100 배)은 일반적으로 필요한, 측정 TF 바인딩 도메인 및 짧은 DNA 올리고, 대략 비슷한 분자 무게의 일반적으로 사이 상호 작용의 금지 . 마지막으로, 전체 적정 곡선은 일반적으로 준비 및 측정 넣는 종족에 대 한 집중 시리즈를 포함 하는 여러 우물의 필요 합니다.
이러한 문제를 해결 하려면 높은 검출 감도 달성 하는 단일의 다른 z 위치에 FA 측정 허용 수정 widefield 현미경 설치를 사용 합니다. 이 바인딩 높은 선호도 유사한 분자량의 종 사이 상호 작용을 모니터링 하는 데 수 있습니다. 더 높은 처리량 멀티 잘 플레이트 형식 고 잘 제어 전달 시스템 (그림 1a)를 사용 하 여 단일에서 전체 적정 시리즈에 FA를 측정 하 여 이루어집니다. 또한, 경쟁력 있는 바인딩 분석 결과 사용 하 여 우리를 바인딩 상수 뿐만 아니라 활성 단백질의 농도 추출. 이것은 분석 결과의 중요 한 특징만 표현된 TF 분자의 일부는 활성 단백질 misfolding 또는 저하 때문. 실험적인 체제 XY 및 Z 피 단계를 갖춘 상업 epifluorescence 현미경을 기반으로 합니다. 우리는 외부 레이저 여기, 시스템 업그레이드 후 두 빛 감지 (그림 1b 와 c 1)에 대 한 높은 양자 효율을 가진 EM-CCD 카메라의 칩에 선형 분극 부품 방출 감지. 시스템 매우 민감한 센서를 결합 하는 높은 수 가늠 구멍 (NA) 목표를 사용 하 고 따라서 매우 민감한 FA 측정을 준다. 형광 z 더미를 기록 하 여 상호 작용을 바인딩 측정할 수 있습니다 광학 z 축을 따라 반응 물에 대 한 이기종 매트릭스를 사용 하는 경우. 이러한 모든 수정 기존 시스템에 쉽게 구현할 수 있으며 비용 효율적인.
우리는 레이블 없는 DNA 올리고 머의 바인딩 선호도 참조로 붙일 레이블된 DNA에 비해 측정 경쟁 바인딩 분석 결과 사용 합니다. TF와 참조 DNA 다공성 agarose 젤 매트릭스 (기 공 크기 ~ 1 µ m)를 구성 하는 바인딩에 대 한 비-상호 작용 하는 환경에서에서 고정된 농도에 통합 됩니다. 참조가 DNA Cy5로 표시 됩니다. 이 염료는 상대적으로 긴 형광 일생 때문에 FA 측정 적합 입증 (~ 1ns)와의 가시 (낮은 자동 형광 배경)는 빨강에서 형광 방출. TF 농도 Cy5 참조 DNA, 모든 참조 DNA 단백질에 바인딩됩니다 보장에 어 금 니 과잉에 있다. 레이블이 없는 경쟁 DNA의 해결책 다음 젤 표면에 입금 됩니다 및 z에 따라 변화 하는 농도 기온 변화도 c (z, t)를 수립 다공성 매트릭스 내부 확산-초점 비행기 및 시간 t (그림의 위치 1는, 그림 2-2 c a). Cy5 참조 DNA에 바인딩된 TF 따라서 로컬 Cy5 참조 DNA FAREF(z, t) 의 동적 변화 FA로 이어지는 DNA 바인딩, 경쟁 하는 경쟁 업체의 다른 농도에 노출 된 (그림 2b 와 2 c).
확인 하려면 경쟁 농도 c(z,t), 우리는 별도 우물 (교정 웰) 동적으로 변화 FA 나 일 블루 (NB) FANB(z, t) 의 신호에 측정 (그림 2는 3와). 이 염료 DNA로 intercalates 그리고 그로 인하여 경쟁 DNA에 대 한 DNA 센서 역할. 이 제어 전달 시스템과 다른 DNA-단백질 바인딩 선호도의 수백 수만 하나 다 잘 플레이트 (96 또는 384 잘 플레이트 형식) 내에서 측정할 수 있습니다. 측정은 다음 TF에서 레이블이 참조 DNA의 전체 변위까지 순차적으로 수행 됩니다. 우리는 길이 N의 합의 시퀀스의 모든 3 N 단일 기반 돌연변이의 선호도 측정 하 여 지정 된 요소에 대 한 바인딩 특이성을 결정. 힙합-FA 단백질의 낮은 금액을 요구 한다 (~ 적정 곡선 당 pmols) 쇼 낮은 비교적 큰 규모에 측정을 하면서 KDs [편차 (CV) < 20%의 계수]의 결정에 변화. 메서드를 사용 하면 수동으로 또는 완전히 자동화 로봇 시스템, 더 낮은 CVs (그림 4, 상단 패널) 결과 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 분리 상수 0.5까지 높은 정확도로 측정 된다 nM. 매우 높은 선호도 (KD < 500 분), 우리 (< 100 nM) 낮은 수준 경쟁 DNA 농도 측정에 있는 부정확 때문에 표준 경쟁 적정 (그림 5)를 사용 하 여.
엉덩이 빠는 거의 모든 표준에 구현, 반전, epifluorescence 형광 현미경, 자동된 XY 스테이지와 압 전 z 축 스테이지의 가용성을 제공 수 있습니다. 광학 부품 장거리 목표를 갖춘 자동된 widefield 설치의 주위에 건설 되었다. 실제로, 분석 결과 (특정 작업, 거리 및 조리개 수치)에서 다른 특성을 가진 목표에 적용할 수 있습니다. 그러나이 매개 변수 최적화를 필요로 하는, ( z사이의 거리-조각 다공성의, 및 높이 agarose 젤, 등.). 레이저 또는 카메라의 다른 종류의 사용도 가능 하다. 전체 실험 절차 및 자료 분석에 대 한 자세한 설명은 아래 프로토콜 섹션에서 제공 됩니다.
HiP-FA TF DNA 상호 작용의 바인딩 기본 설정 풍경을 결정 하기 위한 포괄적인 새로운 방법입니다. 변종의 mutational DNA 모티브 직접 바인딩 기본 임계값 위에 바인더의 집합에 뉴클레오티드 발생의 주파수에 반영 됩니다 어떤 근본적인 가정 피하 바인딩 선호도 측정 합니다. 측정은 동원 정지 및 바인딩 반응, 평형 조건에 최대한 가깝게 기계적 또는 화학적 간섭 없이 솔루션에서 일어난다. 제어 전달 시스템 잘 단일 내에서 전체 적정 곡선의 측정을 허용 하 고 단백질을 절약 하는 동안 처리량과 안정성을 증가 시킵니다. 높은 빛 수집 효율 높은 수 가늠 구멍 및 EM-CCD 카메라와 함께 목표를 사용 하 여 매우 민감한 형광 빛 감지 수 있습니다. 따라서,이 설정으로 작은 FA 변경 낮은 10-15 mP는 정확 하 게 검출 될 수 있다; 실제로, 즉 대량 증가 후 바인딩 최소화 (낮은 2의 대량 비율으로) 쉽게 감지 되는 어떤 바인딩 반응. 이것은 보통 microplate 리더 같은 상용 시스템의 경우입니다. 그것의 높은 감도 때문에 엉덩이-FA 분리 상수 picomolar 범위에 안정적으로 측정할 수 있는 범위를 확장 합니다. 결합 에너지는 여러 개의 크기 순서에 정확 하 게 결정 됩니다.
수정 된 Pwm의 품질을 평가, 하 우리는 두 가지 유형의 분석20수행. 우리는 분할 유전자 네트워크의 5 개 요인에 대 한 다른 Pwm 21 분할 유전자의 genomic 지구에서 실험 칩 seq 프로필을 예측할 수 있는 얼마나 잘 테스트. 두 번째 테스트로 서 우리 식 참여 TFs의 바인딩 기본 설정 및 단백질 농도 기준 세분화 강화의 패턴을 예측 하는 시퀀스 식 모델4 를 사용 합니다. 둘 다 연습에서 우리 덜 특정 엉덩이-FA Pwm 크게 수행 하는 발견 보다는 보다 구체적인 프린팅 B1H Pwm20.
드 노 보 의 방법과 달리 엉덩이-FA 주어진된 TF의 바인딩 설정의 몇 가지 사전 지식이 필요합니다. 그러나, 합의 시퀀스 많은 TFs에 대 한 알려져 있다 그리고 많은 기존의 방법13,,1415그들을 제공할 수 있습니다. 필요 하다 면, 진정한 최적의 바인딩 시퀀스는 반복적으로 찾을 수 있습니다.
우리는 DNA 참조 올리고 붙일 Cy5와 Bodipy-650 개 사용. 이 염료는 바운드와 언바운드 표시 참조 DNA의 이방성은 다른 테스트 염료 중에서 가장 큰 이후 FA 측정용 잘 수행을 입증 했다. 이 FA 값에 대 한 최대 동적 범위를 보장합니다. 일반적으로, 모든 형광 염료 형광 일생 ≥ 1 ns는 먼저 테스트할 필요 하지만 적당 한 것 같다. 만약에 가능 하다 면, 근처-적외선 범위에서 fluorescing 염료를 사용 하 여 단백질 autofluorescence를 최소화 하는 것이 좋습니다.
실험 절차의 가장 중요 한 단계가입니다 잘 플레이트에 젤 pipetting. 좋은 재현성 젤 볼륨을을 최대한으로 통일 될 필요 합니다. 데이터를 평가할 때 젤 높이 변화 확산 경쟁 DNA 올리고 머 및 따라서 선호도의 명백한 변화에서의 변경으로 변환 됩니다. 이것은 기술 복제에는 분산의 주요 소스 이다. 전자 피펫으로 또는 자동화 기술 사용 하 여 재현성을 향상 시킵니다. 느리고 조심 pipetting으로 젤 내에서 기포를 피할 수 있습니다. 그것은 또한 가능한 작은 지연으로 함께 적정 우물 위에 모든 경쟁 업체 솔루션을 추가 하는 것이 중요입니다. 최고의 재현성에 대 한 전체 프로세스 자동화할 수 있습니다 열 incubators pipetting 로봇을 사용 하 여. 자동화 프로토콜을 전송 하기 위한 중요 한 부분은 보육 시간과 보육 온도의 필요한 최적화입니다. 젤의 점도 사이의 최적의 균형을 찾을 수 있는지 확인 하십시오 (즉., 너무 추 워)와 단백질 (즉, 너무 섹시 하지)의 안정성. 이 둘을 따라 우물과 사용 하는 단백질의 안정성에는 젤의 분사 속도에.
HiP-FA 경쟁 DNA 올리고에 대 한 제어 전달 시스템을 사용 합니다. Titrations 커브를 생성, 그것은 각 주어진된 z에 대 한 경쟁 DNA 농도 c(z,t) 를 결정 하는 데 필요한-젤 매트릭스 내에서 위치와 지점 t시간. 이것은 또 다른 중요 한 단계 이후 KDs 의 c(z,t)에 직접 따라 달라 집니다. DNA 농도 센서로 NB 염료를 포함 하는 교정 웰 (d그림 1, 그림 2는)이이 목적을 위해 사용 됩니다. 일반적으로, 3-5 교정 웰 플레이트 당 주의 포함 하는 충분 하다입니다. 어떤 엉덩이-FA를 평가 하기 전에 실험, NB 보정 곡선 경쟁 다른 농도 (그림 3에서 어떤 시퀀스의 DNA는 agarose 젤에 녹아 NB의 기존 적정 시리즈를 수행 하 여 설정에 대 한 건설 한다 는), 8 단계에 자세히 설명 된 대로. 매우 강한 바인딩 경우 (KD < 500 분), 추정 경쟁 DNA의 낮은 농도의 결정을 위해 사용 된다 제한, 때문에 그것은 직접 측정 보다 덜 정확. 그러나, 같은 낮은 kD의TFs에 대 한 엉덩이-FA 설치 agarose 젤 매트릭스 (그림 5)를 사용 하지 않고 바인딩 버퍼에서 기존의 경쟁 적정을 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어 한 전체 적정 경쟁 DNA의 12 다른 농도가 96 잘 접시의 단일 행에서 수행할 수 있습니다.
제어 배달 시스템도 필요 합니다 빠른 TF DNA 바인딩 속도 안정적인 단백질 보급 이후 agarose 젤은 역동적인 (비록 천천히). 두 속성은 바인딩할 때 그들의 각각 붙일 레이블이 참조 DNA의 TFs의 FA, 시간이 지남에 따라 엉덩이-FA 설치와 직접 테스트할 수 있습니다. 우리는 조사 요인에 대 한 KON 과OFF K 속도 측정 하 고 그들을 초20, 따라 다른 연구30밀리초 순서 발견. 이것은 측정 평형에서 열릴 수 있도록 충분히 빨리 이다. 느린 속도와 다른 바인딩 반응의 경우 경쟁 업체의 확산의 농도 낮추거나 젤 숨 구멍 크기를 감소 하 여 조정 될 수 있습니다. 시험 된 TFs의 경우 모든 빠른 T떨어져 있다 (~ 초), 약 1-2 h의 총 측정 시간 각 측정에서 열역학 평형 보장 하기 위해 충분 하다.
또 다른 잠재적인 문제는 단백질에 관련 된 FA 측정을 변경할 수 있는 단백질의 형성 이다. (Tensides) 같은 다른 첨가제를 포함 하는 다른 버퍼 상태를 사용 하 여 필요한 경우 집계 형성을 방지할 수 있습니다.
우리는 PWM;의 선형성 가정 했습니다. 그러나, 힙합-FA 합의 시퀀스의 모든 가능한 디-뉴클레오티드 돌연변이 포함 하도록 확장할 수 있습니다. 마지막으로, 엉덩이-FA 바인딩 상호 작용의 다른 유형을 측정에 적용할 수 있습니다. 전제 하는 것입니다 사용할 수 있는 적합 한 참조 분자 구속 붙일 붙일 수 있는 단백질. 제어 전달 시스템, 농도 기온 변화도 ligand;의 어떤 종류에 대 한 생성 될 수 있습니다. 따라서, 마약-단백질 및 단백질-단백질 상호 작용 마찬가지로 높은 충실도 및 처리량으로 측정할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리 제이 뮐러 cDNA 클론 및 특히 S. Bergelt 갈리아 연구소의 구성원에 대 한, 귀중 한 조언과 심도 있는 토론에 대 한 감사합니다. 이 작품은 SFB 646, 게놈 식 및 유지 보수 (C.J., 샌드위치), 통합 단백질 과학 (U.G.)를 위한 센터 및 대학원 양적 생물 과학 뮌헨 (석사)에 대 한 규제 네트워크에 의해 지원 되었다. U.G. Bundesministerium 위한 Bildung und Forschung (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), 도이치 가운데에 의해 지원 인정 (BMBF: ebio-Innovationswettbewerb Systembiologie), 훔볼트 재단 (알렉산더 폰 훔볼트, 교수)입니다.
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
Nile Blue A | Sigma | N5632-25G | |
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS | Greiner | 655891 | 175 µm thick glass bottom |
384 Well Sensoplate, black | Greiner | 788896 | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-50G | |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Tween-20 | Sigma | P1379-1L | |
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Merck | 1.05099.1000 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.04873.1000 | |
Q-POD Element | Merck Millipore | ZMQSP0DE1 | |
Millipak 40 Gamma Gold Filter | Merck Millipore | MPGL04GK2 | |
Milli-Q Integral 3 Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ003WW | |
Quantum TIX | Merck Millipore | QTUMOTIX1 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
Mastercycler gradient | Eppendorf | Z316083 | |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP | Sarstedt | 72.737.002 | |
MICROSCOPY SETUP: | |||
Automated widefield microscope | LEICA | DMI6000 | |
Long distance objective | LEICA | HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry | |
638 nm line continuous diode laser | Omicron | PHOxX 638-40, 40mW | |
Back-illuminated EM-CCD Camera | Andor | iXon DV897 | |
Dichroic mirror | AHF | 640nm cut-off | |
Bandpass filter | AHF | ET bandpass 700/75 | |
Linear polarizer | Thorlabs | LPVISC050-MP2 | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | BS010 | |
Achromatic lens | Thorlabs | 200 mm focal length | |
Multimode optical fiber | Optronis | FVP600660710 | |
ROBOTIC SYSTEM: | |||
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper | Beckman Coulter | Biomek NXP | |
SOFTWARE: | |||
Programming language | National Instruments | Labview 9.0 | |
Script for the HiP-FA software available at | https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA |