ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר
Summary
המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.
Abstract
פיגומים מהונדסים נגזר מטריצה חוץ-תאית (ECM) יש עניין משמעותי מונע ברפואה על הפוטנציאל שלהם ב לזירוז פצע הסגר וריפוי. מיצוי של מטריצה חוץ-תאית fibrogenic תא תרבויות במבחנה יש פוטנציאל לדור של ה-ECM של שורות תאים אנושיים – ואת פוטנציאל ספציפי לחולה, מזעור הנוכחות של epitopes xenogeneic אשר יש הפריע במישור הקליני הצלחה של מוצרים קיימים כמה ECM. אתגר משמעותי בייצור במבחנה של ECM מתאימים להשתלה הוא ECM הייצור על ידי תרבית תאים הוא בדרך כלל של תשואה נמוכה יחסית. בעבודה זאת, מתוארים פרוטוקולי לייצור של ECM על ידי תאים בתרבית בתוך הולופייבר ההקרבה ממברנה פיגומים. הולופייבר ממברנות תרבותי עם שורות תאים פיברובלסט במדיום תא קונבנציונאלי, התפרקה לאחר תרבית תאים להניב הליכי משנה רציף של ECM. הסיבים ECM וכתוצאה מכך המיוצר על ידי שיטה זו יכולה להיות decellularized, lyophilized, טיוח זה מתאים לאחסון, השרשה.
Introduction
פיגומים כירורגי מושתלת הם אביזר של תיקון הפצע, עם למעלה ממיליון רשתות שינוי של פולימר סינטטי מושתל ברחבי העולם בכל שנה על דופן הבטן תיקון לבד1. עם זאת, בעקבות ההשתלה פולימרים חומרים סינתטיים באופן מסורתי בשימוש פבריקציה נוספת של פיגומים אלה נוטים לעורר תגובה גוף זר, והתוצאה היא דלקת ברישול לפונקציה של השתל, הצטלקות של רקמת2 . עוד יותר, כמו החומרים השולט סינתטי רשת (קרי, פוליפרופילן) הם לא ניכרת שופצה על ידי הגוף, הם חלים באופן כללי על רקמות בו צלקות יכול להיות נסבל, הגבלת התועלת הקלינית שלהם כלפי הטיפול רקמות עם מיומנויות תפקוד כגון שרירים. אמנם יש הרבה מוצרים כירורגי אשר הוחלו בהצלחה קליני, יצרן האחרונים נזכר של סינתטיים כירורגי רשתות וסיבוכים של רקמות בין זנים שתלים להדגיש את החשיבות של הגדלת שתל הביו, הצגת ה-FDA לחדק תקנות על ניתוח mesh יצרני3,4. השרשה של פיגומים שמקורם ברקמות של המטופלים מפחיתה את התגובה החיסונית, אך יכול לגרום תחלואה משמעותית תורם-אתר5. מטריצה חוץ-תאית (ECM) פיגומים המיוצר במבחנה הם חלופה אפשרית, כמוצג פיגומים ECM decellularized הביו מעולה, במיוחד במקרה של ECM עצמיים שתלים6.
בגלל המוגבל של הרקמה החולה כדי לקצור להשתלה עצמיים הסיכון של הפגיעה פונקציה באתר התורם, היכולת לייצר ECM פיגומים במבחנה מתוך התרבות של שורות תאים אנושיים, או, במידת האפשר, של החולה התאים עצמו הוא חלופה אטרקטיבית. האתגרים העיקריים בייצור של כמויות ניכרות של ECM במבחנה הוא פחמיות של מולקולות אלה קשה ללכידת. בעבודה הקודמת, הראו כי ה-ECM יכול להיות מיוצר על ידי culturing מפריש ECM fibroblasts ב קצף פולימריים ההקרבה זה הם התפרקה לאחר תקופת תרבות כדי ECM התשואה אשר יכול להיות decellularized עבור ההשתלה7, 89,,10. ECM מיוצר קצף נוטים לאמץ את הארכיטקטורה הפנימית של קצף, הולופייבר ממברנות (HFMs) היו חקר בדומה לפיגום ההקרבה לייצור חוטי ECM. כפי שיתואר בהמשך אתה שיטות המוטל על מעבדה קנה המידה של הייצור של תאים תרבות איכות הולופייבר ממברנות ומתקני הפקת בצובר מטריצה חוץ-תאית סיבים מאותו לאחר תקופה של פיברובלסט תרבות. גישה זו תרבות סטטית היא ברצון לאימוץ על ידי מעבדות המכיל ציוד תרבות רגיל בתרבית של תאים. יכול להיות מיושם ECM המיוצר על ידי גישה זו כלפי מגוון רחב של יישומים קליניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
התהליכים המתוארים מאפשרים הייצור של צובר ECM biomaterials במבחנה באמצעות ממברנות הולופייבר להטיל על-ידי מערכת ספינינג רטוב יבש-סילון ומאפשר לייצור זול בצובר של ממברנות, כמו גם ציוד תרבות תא סטנדרטי. בעוד הקרומים מפוברק פרוטוקול זה מיועדות לשימוש בתרבית תאים, המערכת המתוארת ניתן להתאים גם ל?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי של דלקת מפרקים, השלד והשרירים ומחלות עור של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R15AR064481, הקרן הלאומית למדע (CMMI-1404716), כמו גם מכון החיים ארקנסו.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
Referências
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
