Productie van extracellulaire Matrix vezels via cultuur van de cel van de membraan van opofferende holle vezel
Summary
Het doel van dit protocol is productie van hele extracellulaire matrix vezels die voor reparatie van de wond wordt gericht die geschikt voor preklinische evaluatie als onderdeel van een regeneratieve steiger implantaat zijn. Deze vezels worden geproduceerd door de cultuur van fibroblasten op holle vezel membranen en geëxtraheerd door ontbinding van de membranen.
Abstract
Gemanipuleerde steigers afgeleid van extracellulaire matrix (ECM) hebben gedreven significant belang in de geneeskunde voor hun potentieel in de bespoediging van de wond sluiting en genezing. Extractie van extracellulaire matrix van fibrogenic cel culturen in vitro heeft potentieel voor generatie van ECM van menselijke- en potentieel patiënt-specifieke cellijnen, minimaliseren van de aanwezigheid van XENOGENECELLEN epitopes die heeft belemmerd de klinische succes van sommige bestaande ECM-producten. Een belangrijke uitdaging in in vitro -productie van ECM geschikt voor implantatie is dat ECM productie door celkweek meestal voor relatief lage opbrengst. In dit werk, worden protocollen beschreven voor de productie van ECM door cellen gekweekte binnen opofferende holle vezel membraan steigers. Holle vezel membranen zijn gekweekt met fibroblast cellijnen in een conventionele cel medium en ontbonden na celkweek continue draden van ECM opleveren. De resulterende ECM vezels geproduceerd door deze methode kunnen worden decellularized en gelyofiliseerde vorm, waardoor het geschikt is voor opslag en implantatie.
Introduction
Implanteerbare chirurgische steigers zijn een bevestiging van de reparatie van de wond, met meer dan een miljoen synthetisch polymeer mazen geïmplanteerd wereldwijd jaarlijks buikwand reparatie alleen1. Echter, na implantatie de synthetische materialen polymeren van oudsher in de fabricage van deze steigers gebruikt de neiging om te provoceren een vreemd lichaam reactie, resulterend in ontsteking schade wordt berokkend aan de functie van het implantaat en littekens van weefsel2 . Verder, zoals de overheersende synthetische mesh-materiaal (dat wil zeggen, polypropyleen) zijn niet merkbaar verbouwd door het lichaam, ze zijn algemeen van toepassing op weefsels waar littekens kan worden getolereerd, beperken hun klinische nut richting de behandelingvan weefsels met hogere-orde functie zoals spier. Hoewel er vele chirurgische mesh-producten die zijn vereffend met klinische succes, herinnert recente fabrikant van synthetische chirurgische netten en complicaties van interspecies weefsel implantaten wijzen op het belang van het maximaliseren van implantaat biocompatibiliteit, waarschuwing van de FDA te scherpen verordeningen op chirurgische mesh fabrikanten3,4. Implantatie van steigers uit patiënten eigen weefsels verkregen vermindert deze immuunrespons, maar kan leiden tot belangrijke donor-site morbiditeit5. Extracellulaire matrix (ECM) steigers, geproduceerd in vitro zijn een mogelijk alternatief, zoals decellularized ECM steigers exposeren uitstekende biocompatibiliteit, met name in het geval van autologe ECM implantaten6.
Vanwege de beperkte beschikbaarheid van weefsel van de patiënt om te oogsten voor autologe implantatie en het risico van het belemmeren van de functie op de site van de donor, het vermogen te produceren ECM steigers in vitro van de cultuur van menselijke cellijnen of, indien mogelijk, van een patiënt eigen cellen is een aantrekkelijk alternatief. De belangrijkste uitdagingen bij de vervaardiging van aanzienlijke hoeveelheden van ECM in vitro is de vastlegging van deze moleculen moeilijk-aan-vangst. In eerdere werk, hebben wij aangetoond dat ECM kan worden geproduceerd door het kweken van ECM-afscheidende fibroblasten in opofferende polymere schuimen die zijn ontbonden na de periode van de cultuur aan opbrengst ECM die kan worden decellularized voor implantatie7, 8109,,. ECM geproduceerd in schuim de neiging aan te nemen van de interne architectuur van het schuim, holle vezel membranen (HFMs) werden verkend als een offer steiger voor productie van draden voor ECM. Hierin beschreven zijn methoden belast voor lab schaal vervaardiging van cultuur kwaliteit holle vezel celmembranen en de winning van bulk extracellulaire matrix vezels uit hetzelfde na een periode van fibroblast cultuur. Deze statische cultuur aanpak is gemakkelijk adoptable door laboratoria met standaard zoogdieren cel cultuur apparatuur. ECM geproduceerd door deze aanpak kan worden toegepast naar een scala aan klinische toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven procédés in staat stellen de productie van de bulk ECM biomaterialen in vitro met holle vezel membranen gegoten door een systeem van de dry-jet natte spinnen waardoor voor goedkope bulk productie van membranen evenals standaard cel cultuur apparatuur. Terwijl de membranen vervaardigd in dit protocol zijn bedoeld voor gebruik in de cultuur van de cel, kan het systeem beschreven ook worden aangepast voor de productie van membranen voor scheiding doeleinden, met porie instelbare distributie en holle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het nationale Instituut van artritis en Musculoskeletal en ziekten van de huid van de National Institutes of Health award onder nummer R15AR064481, de National Science Foundation (CMMI-1404716), evenals de Arkansas Biosciences Instituut.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
Referências
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
