Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim
Summary
Bu iletişim kuralı bir rejeneratif iskele implant parçası olarak preklinik değerlendirme için uygun olan yara onarım için hedeflenen tüm hücre dışı matriks elyaf üretim hedeftir. Bu iplikler fibroblastlar hollow fiber membranlar üzerinde kültür tarafından üretilen ve membranlar dağılması tarafından ayıklanır.
Abstract
Hücre dışı matriks (ECM) türetilmiş mühendislik iskele kapanması ve şifa yara hızlandırdığını onların potansiyel için ilaç tahrik önemli ilgim yok. Hücre dışı matriks çekme–dan fibrogenic hücre kültürleri vitro ECM üretimi klinik engel xenogeneic epitopları varlığı en aza indirme insan – ve potansiyel olarak hasta özel hücre satırlarından için potansiyeli Bazı varolan ECM ürünler başarısı. ECM implantasyon için uygun vitro üretiminde önemli bir meydan okuma ECM üretim hücre kültürü tarafından genellikle nispeten düşük verim olmasıdır. Bu çalışmada, hücreleri kurban hollow fiber membran iskele içinde kültürlü tarafından ECM üretimi için iletişim kuralları anlatılmaktadır. Hollow fiber membranlar geleneksel cep orta fibroblast hücre hatları ile kültürlü ve ECM sürekli konuları vermeye hücre kültürü sonra çözünmüş. Bu yöntemle üretilen elde edilen ECM elyaf decellularized ve liyofilize, depolama ve implantasyon için uygun işleme.
Introduction
İmplante edilebilir cerrahi iskele bir fikstür yara onarım, dünya çapında her yıl karın duvarı tamir yalnız1için implante bir milyonu aşkın sentetik Polimer kafesler ile vardır. Ancak, sentetik malzemeler polimerler, geleneksel olarak bu iskele imalatı kullanılan implantasyon ardından implant işlevi için zararlı iltihap sonucu ve skar dokusu2 bir yabancı cisim tepki uyandirmak eğilimindedir . Baskın sentetik kafes malzemeleri (Yani, Polipropilen) kayda değer vücut tarafından yenilenmiş değil gibi daha fazla, onlar nerede skarlasma tolere, dokulara genellikle tabidir klinik kullanışlılığı tedavisinde doğru sınırlama kas gibi üst düzey işlev kurcalayarak. Klinik başarı ile uygulanan birçok cerrahi mesh ürün olmakla birlikte, son üretici kafesler ve türler arası doku implantları komplikasyonlar implant en üst düzeye çıkarma önemini vurgulamak sentetik cerrahi hatırlıyor biyouyumluluk, cerrahi düzenlemelerini sıkılaştırmak için FDA isteyen Üreticiler3,4kafes. Hastaların kendi dokulardan türetilmiş iskele implantasyonu bu bağışıklık yanıtı azaltır, ancak önemli donör-site morbidite5‘ te neden olabilir. Hücre dışı matriks (ECM) üretilen iskele vitro decellularized ECM iskele mükemmel biyouyumluluk, sergilemek gibi mümkün olan bir alternatif, özellikle otolog ECM durumunda6implantlar var.
Otolog implantasyonu hasat için hasta doku sınırlı kullanılabilirlik ve donör sitesinde işlevini engelleyen riski nedeniyle, ECM üretmek için yetenek vitro insan hücre hatları ile kültür iskele veya mümkünse bir hastanın kendi hücreleri cazip bir alternatif olduğunu. Bu yakalama zor moleküller haciz ECM vitro önemli miktarda üretiminde birincil sorunları var. Önceki çalışmalarda, ECM ECM-salgılayan fibroblastlar implantasyon7, için decellularized verim ECM kültür döneminden sonra çözünmüş kurban polimerik köpükler içinde kültür tarafından üretilen göstermiştir 8,9,10. ECM üretilen köpükler Köpükler iç mimarisini kabul eğilimindedir, hollow fiber membranlar (HFMs) konuları ve ECM üretimi için kurban bir iskele olarak keşfedilmeyi. Laboratuvar ölçekli için hücre kültür kalite hollow fiber zarları ve toplu hücre dışı matriks elyaf çekme–dan aynı döneminden sonra fibroblast kültürünün imalatı burada açıklanan yöntemleri görevli vardır. Bu statik kültür standart memeli hücre kültür donanımları içeren laboratuvarları tarafından kolayca adoptable yaklaşımdır. Bu yaklaşım tarafından üretilen ECM çeşitli klinik uygulamaları doğru uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan işlemleri bir kuru-jet ıslak eğirme sisteminde membranlar hem standart hücre kültür malzemesi ucuz toplu üretimi için artığını hollow fiber membranlar kullanarak toplu ECM Biyomalzeme vitro üretimini sağlar. Bu protokol için fabrikasyon membran hücre kültüründe kullanmak içindir iken, açıklanan sistem ayrıca membran ayırma amacıyla, gözenek boyutu dağıtım ve içi boş lif boyutları değişen tarafından ayarlanabilir ile üretim için adapte edilebilir spinneret boyutlar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırma Ulusal Enstitüsü artrit ve Musculoskeletal ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numaradaki R15AR064481, Ulusal Bilim Vakfı (CMMI-1404716), cilt hastalıkları tarafından desteklenen yanı sıra Arkansas Biosciences Enstitüsü.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
Referências
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
