Producción de fibras de la matriz extracelular mediante cultivo de células de membrana de fibra hueca sacrificio
Summary
El objetivo de este protocolo es la producción de fibras de la matriz extracelular todo destinados a la reparación de la herida que son adecuados para la evaluación preclínica como parte de un implante de andamio regenerativa. Estas fibras se producen por la cultura de los fibroblastos en las membranas de fibra hueca y extraídas por disolución de las membranas.
Abstract
Andamios de ingeniería derivados de matriz extracelular (ECM) tienen conducido gran interés en medicina por su potencial de acelerar el cierre y cicatrización de la herida. Extracción de la matriz extracelular de fibrogénicos celular cultivos en vitro tiene potencial para generación de ECM de líneas celulares humanas – y potencialmente específico para cada paciente, minimizando la presencia de epitopos xenogeneicos que ha dificultado la clínica éxito de algunos productos de ECM existentes. Un reto importante en la producción en vitro de ECM adecuado para la implantación es que producción de ECM por cultivo celular suele ser de relativamente bajo rendimiento. En este trabajo, se describen los protocolos para la producción de ECM por células cultivadas en andamios de membrana de fibra hueca sacrificial. Membranas de fibra hueca son cultivadas con líneas celulares de fibroblastos en un medio celular convencional y disuelto después de cultivo celular para producir filamentos continuos de ECM. Las fibras del ECM resultantes producidas por este método pueden ser decellularized y liofilizadas, haciéndola conveniente para el almacenaje y la implantación.
Introduction
Andamios quirúrgicos implantables son un accesorio de la reparación de la herida, con mallas de polímeros sintéticos más 1 millón implantado en todo el mundo cada año para reparación de pared abdominal solo1. Sin embargo, tras la implantación de los polímeros sintéticos materiales tradicionalmente utilizados en la fabricación de estos andamios tiende a provocar una respuesta de cuerpo extraño, resultando en inflamación deletérea para la función del implante y cicatrización del tejido2 . Además, como los materiales predominantes de malla sintética (es decir, polipropileno) apreciable no son remodelados por el cuerpo, son generalmente aplicables a los tejidos donde se pueda tolerar una cicatriz, limitando su utilidad clínica hacia el tratamiento de tejidos con función de orden superior tales como músculo. Si bien hay muchos productos de malla quirúrgica que han sido aplicados con éxito clínico, fabricante reciente recuerda de sintético quirúrgico mallas y complicaciones de los implantes de tejido entre las especies destacan la importancia de maximizar el implante biocompatibilidad, incitando a la FDA para apretar regulaciones sobre quirúrgica malla fabricantes3,4. Implantación de andamios derivados de tejidos de pacientes reduce esta respuesta inmunitaria, pero resulta en el sitio donante importante morbilidad5. Matriz extracelular (ECM) andamios producidos en vitro son una posible alternativa, como andamios de ECM decellularized exhiben excelente biocompatibilidad, particularmente en el caso de ECM autólogo implantes6.
Debido a la limitada disponibilidad de tejido de la paciente de cosecha para implante autólogo y el riesgo de obstaculizar la función en el sitio donante, la capacidad de producir ECM andamios en vitro de la cultura de líneas celulares humanas o, si es posible, un paciente células propias es una alternativa atractiva. Los retos principales en la fabricación de cantidades sustanciales de ECM en vitro es el secuestro de estas moléculas de difícil captura. En trabajos previos, hemos demostrado que el ECM puede ser producido por cultivo de fibroblastos secretoras de ECM en sacrificio espumas poliméricas que se disuelven después del período de la cultura a ECM de rendimiento que puede ser decellularized de implantación7, 8,9,10. Como ECM producido en espumas tienden a adoptar la arquitectura interna de las espumas, las membranas fibra hueca (HFMs) fueron exploradas como andamio sacrificial para la producción de hilos de ECM. Descritos métodos encargados de laboratorio de la escala de la fabricación de membranas de fibra hueca de calidad de cultura de celulares y la extracción de fibras de la matriz extracelular de bulto de la misma tras un período de cultivo de fibroblastos. Este enfoque de cultura estática es fácilmente adoptable por los laboratorios que contienen equipos de cultura de célula mamífera estándar. ECM producida por este método podría aplicarse a una variedad de aplicaciones clínicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los procesos descritos permiten la producción de granel ECM biomateriales en vitro con membranas de fibra hueca de un sistema de hilado húmedo seco-jet que permite para la producción a granel barato de membranas así como el equipo de cultura de célula estándar. Mientras que las membranas fabricadas en este protocolo están diseñadas para uso en cultivo celular, el sistema descrito también puede ser adaptado para la producción de membranas para fines de separación, con poro tamaño distribución y hueco…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de artritis y lesiones músculo-esqueléticas y enfermedades de la piel de los institutos nacionales de salud bajo el número de concesión R15AR064481, la National Science Foundation (CMMI-1404716), así como Instituto de biociencias de Arkansas.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
Referências
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