Zebrafish è un sistema di modello che ha molte caratteristiche importanti, compreso chiarezza ottica, rapido sviluppo esterno e, di particolare importanza nel campo dell’udito e l’equilibrio, situato esternamente cellule ciliate sensoriali. Questo articolo descrive come transgenici zebrafish può essere utilizzato per analisi sia delle cellule cigliate mechanosensation e funzione presinaptica in toto.
Cellule ciliate sensoriali sono meccanorecettori trovati nell’orecchio interno che sono necessari per l’udito e l’equilibrio. Le cellule ciliate sono attivate in risposta a stimoli sensoriali che meccanicamente deviare protrusioni apicali chiamati pacchi dei capelli. Deflessione apre canali di meccanotrasduzione (MET) in pacchi dei capelli, che conduce ad un afflusso di cationi, compreso il calcio. Questo afflusso di catione depolarizza la cellula e apre i canali tensione-gated del calcio basally situati presso la presynapse della capelli-cellula. Nei mammiferi, le cellule ciliate sono racchiusi nell’osso ed è difficile da valutare funzionalmente queste attività in vivo. Al contrario, larvale zebrafish sono trasparenti e possiedono un organo situato esternamente di linea laterale che contiene le cellule ciliate. Queste cellule ciliate sono funzionalmente e strutturalmente simili ai mammiferi le cellule ciliate e funzionalmente valutabili in vivo. Questo articolo viene descritta una tecnica che utilizza un indicatore di calcio codificato geneticamente (GECI), GCaMP6s, per misurare stimolo-evocato calcio segnali nelle cellule ciliate di zebrafish linea laterale. GCaMP6s può essere utilizzato, insieme con rappresentazione confocale, per misurare i segnali di calcio in vivo al vertice e alla base delle cellule ciliate linea laterale. Questi segnali forniscono una lettura in tempo reale a quantificabile delle due attività di calcio mechanosensation – e presynapse-dipendente all’interno di queste cellule ciliate. Questi segnali di calcio anche forniscono importanti riguardanti funzionale come cellule ciliate rilevare e trasmettere stimoli sensoriali. Nel complesso, questa tecnica genera dati utili sulle variazioni relative nelle attività del calcio in vivo. È meno adatta per la quantificazione della magnitudine assoluta di cambiamenti di calcio. Questa tecnica in vivo è sensibile agli artefatti da movimento. Una quantità ragionevole di pratica e abilità sono necessari per il corretto posizionamento, immobilizzazione e stimolazione delle larve. In definitiva, quando correttamente eseguita, il protocollo descritto in questo articolo fornisce un modo potente per raccogliere preziose informazioni circa l’attività delle cellule ciliate nei loro Stati naturali, completamente integrati all’interno di un animale vivo.
Formazione immagine funzionale del calcio è un potente strumento che può essere utilizzato per monitorare l’attività di molte cellule contemporaneamente1. In particolare, la formazione immagine del calcio utilizzando indicatori codificato geneticamente calcio (GECIs) ha dimostrata di essere vantaggioso perché GECIs può essere espressa in tipi cellulari specifici e localizzati subcellularly2. In ricerca in neuroscienza, queste caratteristiche hanno reso imaging di calcio utilizzando GECIs un potente metodo per definire i modelli di attività all’interno di reti neuronali sia misurare l’afflusso del calcio alle singole sinapsi3,4. Approfittando di queste caratteristiche, un recente studio usato microscopia confocale e GECIs per monitorare l’attività subcellulare all’interno delle collezioni di cellule ciliate sensoriali5.
Le cellule ciliate sono meccanocettori che rilevare stimoli sonori e vestibolari nell’orecchio interno e movimento dell’acqua locale del sistema di linea laterale in acquatica vetebrates6,7. Le cellule ciliate sono spesso bersaglio di danni o mutazioni genetiche che provocano la forma più comune di perdita della capacità uditiva in esseri umani conosciuti come perdita dell’udito neurosensoriale8,9. Pertanto, è fondamentale per capire come queste funzione di cellule al fine di capire come trattare e prevenire la perdita dell’udito. Per funzionare correttamente, le cellule dei capelli utilizzano due strutture specializzate chiamate mechanosensory-capelli bundle e nastri sinaptiche per rilevare e trasmettere stimoli, rispettivamente. Pacchi dei capelli si trovano all’apice delle cellule ciliate e sono costituiti principalmente da sporgenze fine, capelli-come noti come stereocilia (Figura 1A). In cellule ciliate vestibolari e linea laterale, ogni fascio di capelli ha anche un kinocilium lungo singolo (Cilio unica vera della cella), che può estendersi molto di sopra di stereocilia (Figura 1A). Stimoli che mechanosensory deviano pacchi dei capelli, e deflessione mette tensione sulle sinergie chiamati “punta-link” che stereocilia10di interconnessione. Questa tensione apre canali di meccanotrasduzione (MET) situati in stereocilia, risultante in un afflusso apicale dei cationi, tra cui calcio11,12. In definitiva, questa attività apicale depolarizza la cellula ciliata e apre i canali tensione-gated del calcio (Cav1.3) alla base della cella. Canali del CAv1.3 si trovano adiacenti a nastri sinaptiche, una struttura presinaptica che attacchi vescicole alle zone attive. Afflusso del calcio basale attraverso canali del Cav1.3 è necessaria per la fusione della vescicola, neurotrasmissione e attivazione di neuroni afferenti13,14.
Per molti anni, sono stati utilizzati tecniche elettrofisiologiche come cellule intere patch di bloccaggio per sondare le proprietà funzionali delle cellule ciliate in molte specie, tra cui zebrafish15,16,17, 18,19,20. Queste registrazioni elettrofisiologiche sono stati particolarmente preziose nei campi dell’udito e l’equilibrio, perché possono essere usati per ottenere misurazioni estremamente sensibili da singole cellule sensoriali, cui scopo è quello di codificare stimoli estremamente veloci sopra un vasta gamma di frequenze e intensità21,22. Purtroppo, le registrazioni della intero-cellula non possono misurare l’attività delle popolazioni delle cellule ciliate. Per studiare l’attività delle popolazioni di cellule nella linea laterale di zebrafish, potenziali microfonici e afferenti i potenziali di azione sono stati utilizzati per misurare le proprietà di risposta postsinaptica di singoli neuromasts23 e sommati mechanosensitive ,24. Purtroppo, né cellule intere registrazioni né misure potenziali di campo locale hanno la risoluzione spaziale per individuare la cui attività è in corso all’interno di singole celle o misurare l’attività di ogni cella all’interno di una popolazione. Più recentemente, calcio coloranti e GECIs sono state impiegate per bypassare queste sfide25,26.
In zebrafish, GECIs hanno dimostrato di essere un approccio potente per esaminare la funzione di cellula ciliata dovuto la relativa facilità di creazione di zebrafish transgenici e la chiarezza ottica di larve27. Nelle larve di zebrafish, cellule ciliate presenti nell’orecchio interno così come il sistema della linea laterale. La linea laterale è composto da cluster di rosetta-come delle cellule ciliate chiamate neuromasts che vengono utilizzati per rilevare i cambiamenti locali in movimento dell’acqua (Figura 1). La linea laterale è particolarmente utile perché è situata esternamente lungo la superficie del pesce. Questo accesso ha reso possibile stimolare le cellule ciliate e misurare segnali di calcio otticamente in larve intatte. Nel complesso, la facilità di transgenesi, trasparenza delle larve e l’accesso senza pari delle cellule ciliate linea laterale hanno reso zebrafish un prezioso modello per studiare l’attività delle cellule ciliate in vivo. Si tratta di un significativo vantaggio rispetto ai sistemi di mammiferi in cui le cellule ciliate sono circondate da strutture ossee dell’orecchio interno. Questa mancanza di accesso ha reso molto difficile acquisire misure funzionali in vivo delle cellule ciliate dei mammiferi.
Il protocollo descritto qui viene descritto come monitorare le modifiche di canale – e presynapse-dipendente MET di calcio all’interno di singole cellule ciliate e tra le celle all’interno di neuromasts in zebrafish larvale. Questo protocollo utilizza una linea di zebrafish transgenici stabilito che esprime un GCaMP6s membrana localizzato sotto il controllo della capelli-cellula specifica myosin6b promotore28. Questa localizzazione di membrana posizioni GCaMP6s per rilevare l’afflusso del calcio attraverso canali ionici localizzati nelle membrane plasmatiche che sono critici per la funzione delle cellule cigliate. Ad esempio, GCaMP6s membrana localizzato può rilevare calcio afflusso attraverso MET canali in pacchi dei capelli apicale e attraverso CaV1,3 canali vicino a nastri sinaptiche alla base della cella. Questo contrasta con l’utilizzo di GECIs localizzata nel citosol, come GECIs citosolico di rilevare segnali di calcio che sono una combinazione di attivitàV1.3 canale MET e Ca, nonché a contributi di calcio da altre fonti (ad esempio, negozio rilascio). Questo protocollo viene descritto come immobilizzare e paralizzare GCaMP6s larve transgeniche prima di formazione immagine. Viene quindi descritto come preparare e usare un getto di fluido per deviare i fasci di capelli per stimolare le cellule ciliate linea laterale in modo controllato e riproducibile. Vengono presentati dati rappresentativi che possono essere raggiunto usando questo protocollo. Esempi di dati che rappresentano artefatti di movimento sono anche presentati. Esperimenti di controllo che vengono utilizzati per verificare i risultati ed escludere gli artefatti sono descritti. Infine, è descritto un metodo per visualizzare segnali di calcio spaziale nel software Fiji. Questa analisi di Fiji è adattata da metodi di visualizzazione stabiliti in precedenza sviluppati utilizzando MATLAB5. Nel complesso, questo protocollo delinea una tecnica di preparazione potente che utilizza GECIs in zebrafish larvale per misurare e visualizzare la dinamica del calcio capelli-cellula in vivo.
In vivo imaging in animali intatti è intrinsecamente difficile. Diversi passaggi di questo metodo sono fondamentali per ottenere affidabile in vivo misure del calcio dalle cellule ciliate linea laterale. Ad esempio, è molto importante che la larva è bloccata e paralizzata correttamente prima dell’imaging per minimizzare il movimento durante la formazione immagine. Movimento in eccesso durante la formazione immagine può condurre ai cambiamenti in fluorescenza di GCaMP6s che non sono veri segnali e non corrispondono ai cambiamenti nei livelli di calcio (ad es., figure 4B1′-B1 ‘ e 4 C 1′-C1 cm). Perni di coda possono essere posizionati più anteriormente per ridurre al minimo movimento, anche se questo potrebbe rendere più neuromasts posteriore inaccessibile. Inoltre, dopo l’iniezione di cuore, spilli con testa può essere ruotate affinché la parte orizzontale del perno si trova da altra parte il tuorlo. Oltre ad alterare la posizione dei perni, è anche possibile utilizzare un’arpa di cervello-fetta invece di pin per immobilizzare le larve34. Quando posizionata sopra le larve correttamente, un’arpa è un ulteriore, potenzialmente meno invasivo metodo di immobilizzare le larve. Mentre un movimento significativo può derivare da appuntare inadeguata, mancato di eseguire correttamente l’iniezione di cuore per consegnare α-bungarotossina e paralizzare le larve può provocare paralisi incompleta, movimento e in definitiva gli artefatti di movimento. Anche se comunemente utilizzati anestetici sono stati indicati per colpire l’eccitabilità delle cellule ciliate zebrafish, lavoro recente ha indicato che la benzocaina anestetico non interferisce con molti aspetti dell’attività della cellula ciliata. Allo stesso modo, il più comunemente usato anestetico che MS-222 solo interferisce con alcuni aspetti della capelli-cellula attività15. Di conseguenza, a causa della natura impegnativa di α-bungarotossina iniezione, benzocaina o applicazione MS-222 può rivelarsi un utile metodo alternativo della paralisi per impedire il movimento nella larva durante la formazione immagine funzionale del calcio.
Oltre le sfide tecniche coinvolte nel presente protocollo, anche un campione perfettamente montato è inutile se la larva e cellule ciliate non sono sane, prima e durante ogni esperimento imaging. Per garantire che le larve e le cellule ciliate sono sane, è importante che le larve sono mantenute in E3 buffer che è privo di detriti come chorions (gusci d’uovo), rifiuti e microrganismi. Anche se la posizione superficiale delle cellule ciliate linea laterale è vantaggiosa per l’imaging, questa posizione li rende più vulnerabili a danni cellulari quando il buffer di E3 è sporca. Un ambiente pulito, acquoso è particolarmente importante per le giovani larve (2-4 dpf) o mutanti che non possono mantenere una piscina in posizione verticale, posizionare e principalmente giacciono sul fondo del piatto Petri. In queste situazioni, cellule ciliate linea laterale e il cupula protettivo che circonda i pacchi dei capelli può facilmente diventare compromessa. Anche quando si inizia con larve sane e cellule ciliate, nel corso di ogni esperimento, è fondamentale per garantire che la larva ha un battito cardiaco e del flusso sanguigno rapido. Se il flusso di sangue rallenta o si ferma, la salute delle cellule ciliate può diventare compromessa. Nelle preparazioni di compromesse che coinvolgono malsane larve o perdita di flusso sanguigno, morendo le cellule ciliate possa essere identificato in diversi modi: primo, dalla comparsa di karyopyknosis o condensazione nucleare, che si manifesta come una bolla all’interno della cellula sotto ottica DIC; in secondo luogo, di restringimento delle cellule e la presenza di particelle all’interno del citoplasma; in rapido movimento e terzo, quando può consigli di strombatura in diverse direzioni35. Quando i pacchi dei capelli sono interrotti, lo strombato può non spostare coesiva insieme durante la stimolazione.
Questa preparazione ha diversi limiti minori, uno è che la preparazione rimane solo robusta per 1-3 ore dopo che è stata stabilita. Modifiche come l’utilizzo di piccoli perni o una fetta di cervello arpa per immobilizzare le larve e l’aggiunta di un sistema di perfusione può estendere la durata di questa preparazione in vivo . Un’altra limitazione è che photobleaching e fototossicità può verificarsi dopo ripetute prove di formazione immagine. Un modo emozionante per superare questa sfida è quello di adattare questo protocollo per microscopia luce-foglio. Microscopia di luce-foglio è un modo efficace per ridurre la luce del fuoco, che conduce a meno photobleaching e fototossicità36. Insieme, immobilizzazione più delicato e meno foto-esposizione può contribuire a prolungare ogni sessione di imaging. Le sessioni più imaging possono essere utilizzate per esaminare l’intera durata dei cambiamenti funzionali che accompagnano lo sviluppo e i processi che sottendono la clearance delle cellule cigliate e rigenerazione dopo la lesione. È importante sottolineare che, oltre alla microscopia luce-foglio, questo protocollo può essere adattato ad altri sistemi confocal di tipi (punto-scansione, 2-fotone e filatura disco) nonché relativamente semplice widefield sistemi28,34 . Nel complesso, la sua versatilità rende questo protocollo uno strumento prezioso che può essere adattato e utilizzato con più sistemi di imaging.
Mentre questo protocollo può essere adattato e utilizzato con molti sistemi di imaging, parti del presente protocollo possono anche essere adattati e utilizzati (1) con altri indicatori oltre GCaMP6s e (2) l’attività di image in altre cellule sensoriali e neuroni all’interno di zebrafish larvale. Ad esempio, in uno studio precedente, abbiamo utilizzato questo protocollo per attività di immagine utilizzando indicatori più geneticamente codificati all’interno di cellule ciliate linea laterale per rilevare calcio citosolico (RGECO1), fusione della vescicola (SypHy), tensione di membrana (Bongwoori) e membrana calcio (jRCaMP1a-caax e GCaMP6s-caax) e all’interno dei processi afferenti linea laterale per rilevare membrana calcio (GCaMP6s-caax)5. Basandoci sulla nostra esperienza di utilizzo di questi indicatori, la linea transgenica che TG(myo6b:gcamp6s-CAAX) descritto in questo protocollo offre un ottimo inizio per l’imaging di attività in linea laterale neuromasts. Di tutti gli indicatori sopra elencati, abbiamo trovato che GCaMP6s è il più sensibile e fotostabili. Oltre a queste funzionalità, evidenziamo la linea transgenica Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) perché può essere utilizzato per effettuare due misurazioni distinte: cellula ciliata mechanosensation e calcio presinaptico all’interno di una singola linea transgenica.
La tecnica descritta in questo articolo viene illustrato come formazione immagine del calcio in zebrafish linea laterale può essere un metodo efficace per studiare il funzionamento di cellule ciliate in ambiente nativo. Questo approccio è complementare agli studi dei mammiferi in quale cellula ciliata funzione è attualmente allo studio in espianti di ex vivo . Inoltre, il modello di zebrafish può continuare a essere utilizzato come una piattaforma per testare l’efficacia di codificato geneticamente indicatori che possono quindi essere applicate per esaminare l’attività in cellule di mammifero i capelli.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIDCD ricerca intramurale fondi 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vorremmo riconoscere Candy Wong per la sua assistenza nella scrittura la macro di Fiji. Vorremmo anche ringraziare Doris Wu e Candy Wong per loro utili suggerimenti con il protocollo.
Section 1 | |||
α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
Section 2 | |||
Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
Section 3 | |||
Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
Sections 4 & 5 | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
Sections 6, 7 & 8 | |||
Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
Section 9 | |||
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
Section 10 | |||
Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |