Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse
Summary
Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l’isolamento delle cellule staminali neurali dall’eminenza E13 del mouse embrione gangliare.
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) sono multipotenti e può dar luogo a tre tipi di principali delle cellule del sistema nervoso centrale (CNS). Cultura in vitro e l’espansione delle CSN forniscono una fonte di cellule per neuroscienziati studiare la funzione dei neuroni e cellule gliali insieme a loro interazioni. Ci sono diverse tecniche segnalate per l’isolamento delle cellule staminali neurali da cervello mammifero adulto o embrione. Durante l’operazione di microsurgical per isolare NSCs provenienti da diverse regioni del SNC embrionale, è molto importante per ridurre i danni alle cellule cerebrali per ottenere il più alto rapporto delle cellule staminali dal vivo ed espandibile. Una tecnica possibile per ridurre lo stress durante l’isolamento di queste cellule del cervello di embrione di topo è la riduzione dei tempi chirurgici. Qui, dimostriamo una tecnica sviluppata per isolamento rapido di queste cellule dall’eminenza E13 del mouse embrione gangliare. Le procedure chirurgiche sono la raccolta di embrioni di topo E13 dall’utero, tagliando le fontanelle frontale dell’embrione con una punta di ago piegato, estraendo il cervello dal cranio, microdissection del cervello isolato per raccogliere l’eminenza gangliare, dissociazione del tessuto raccolto nel mezzo di NSC per ottenere una sospensione di singola cellula e infine di placcatura cellule nella coltura di sospensione per generare neurosfere.
Introduction
Cellule staminali neurali (NSC) risiedono in diverse regioni del cervello adulto ed embrione e hanno una tendenza a generare diversi tipi di neuroni e cellule gliali1. NSC ricche regioni3subventricular zone nel cervello dei mammiferi adulti2 e gangliare Eminenza nel cervello dell’embrione. Nel cervello in via di sviluppo, l’eminenza gangliare offre la maggior parte dei interneurons corticali e particolarmente di interneuroni GABAergici3. Ci sono anche metodi meno invasivi per la generazione di cellule staminali neurali da cellule staminali embrionali (ESCs) o utilizzare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) che riducono la richiesta per l’animale. Nonostante il fatto che la generazione di NSC da CES o iPSCs è possibile4,5, ha alcuni vantaggi e svantaggi rispetto all’isolamento delle cellule staminali neurali da adulto o embrione cervello6,7, 8. I protocolli per indurre la differenziazione dei CES e iPSCs verso fenotipi neuronali sono sempre tempi e costi di consumo e il tasso di successo (70-80% Nestin cellule positive)5 è inferiore rispetto con isolamento diretto di NSC dal cervello animale ( più di 99% di cellule positive Nestin)9. Inoltre, le cellule staminali perdono loro tendenza stabilità e differenziazione genetica dopo parecchi passaggi10,11. Anche se ci sono altre nuove notizie di conversione diretta delle cellule somatiche in NSC, queste cellule sono geneticamente modificate e non sono facilmente accessibili in ogni laboratorio12. Di conseguenza, c’è ancora una grande richiesta per l’isolamento delle cellule staminali neurali del cervello animale; è possibile ridurre la quantità di utilizzo animali migliorando le tecniche chirurgiche. Riducendo il tempo chirurgico e migliorando le tecniche, è possibile mantenere le cellule dal danno e ottenere il più alto tasso di NSC da ciascun animale.
Qui, presentiamo una tecnica semplificata e riproducibile per l’isolamento delle cellule staminali neurali da cervello di embrione di topo E13 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando una fonte di cellule staminali neurali è molto importante per i neuroscienziati. Cellule staminali neurali potrebbero essere raccolte da diverse aree del cervello embrionale e possono generare tipi specifici di neuroni e cellule gliali. Ci sono diversi metodi per l’induzione della differenziazione delle cellule staminali neurali per indurli a generare cellule gliali e neuroni maturi. Ci sono numerosi rapporti che indicano che in condizioni di impostazioni cultura specifiche e fattore trofico reggimenti, potr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dall’Istituto Royan.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
Referências
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neurociência. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
