Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Summary

Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.

Abstract

Gli osteoclasti sono cellule grandi, multinucleate e di riassorbimento osseo del lignaggio dei monociti-macrofage che sono formate dalla fusione di monociti o precursori di macrofage. Un eccessivo riassorbimento osseo è uno dei meccanismi cellulari più significativi che portano a malattie osteolitiche, tra cui l’osteoporosi, la parodontite e l’osteolisi periprotesica. La principale funzione fisiologica degli osteoclasti è quella di assorbire sia la componente minerale di idrossiapatite che la matrice organica dell’osso, generando l’aspetto caratteristico del riassorbimento sulla superficie delle ossa. Ci sono relativamente pochi osteoclasti rispetto ad altre cellule del corpo, soprattutto nelle ossa adulte. Studi recenti si sono concentrati su come ottenere osteoclasti più maturi in meno tempo, che è sempre stato un problema. Diversi miglioramenti nelle tecniche di isolamento e cultura si sono sviluppati nei laboratori al fine di ottenere osteoclasti più maturi. Qui, introduciamo un metodo che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale, utilizzando un dispositivo speciale e semplice. Con l’uso di centrifugazione a gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati dal midollo osseo del ratto, che sono identificati con metodi classici.

Introduction

L’omeostasi ossea è un processo fisiologico complesso che è regolato da osteoclasti di riassorbimento osseo e osteoblast che formano ossa¹. Un equilibrio tra attività osteoblastica e osteoclastica mediata attraverso osteoblasti e osteoclasti, rispettivamente, è altamente essenziale per mantenere la salute ossea e l’omeostasi, perché le perturbazioni nell’omeostasi ossea possono portare a malattie ossee, come come crescita ossea anormale o perdita di densità ossea. Come cellule di riassorbimento osseo uniche, gli osteoclasti sono importanti nelle malattie legate alla distruzione ossea anormale, tra cui l’osteoporosi, la parodontite e l’osteolisi periprotesica^2,3.

Lo sviluppo di una cultura osteocultima è diviso principalmente in due fasi. I metodi stabiliti da Boyde et al.⁴ e Chambers et al.⁵ hanno composto la prima tappa negli anni ottanta. Hanno ottenuto osteoclasti relativamente abbondanti dalle ossa degli animali appena nati, che è il periodo di rimodellamento rapido. Gli osteoclasti vengono rilasciati frammentare e mescolare le ossa in un mezzo speciale. Tuttavia, le cellule ottenute con questo metodo sono a basso contenuto di quantità e purezza. Il secondo stadio è stato lo sviluppo di colture a lungo raggio di formazione di degli osteoclasti, utilizzando cellule di lignaggio ematopoietiche derivate dal midollo osseo⁶. Le citochines, come 1 α, 25-diidrossiamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2), e l’ormone paratiroideo (PTH), che vengono aggiunti nel mezzo di coltura, agiscono attraverso il sistema di osteoblasti/cellule stromali per stimolare la formazione di degli osteoclasti^7,8 . Tuttavia, la purezza e la quantità degli osteoclasti ottenuti con questo metodo non possono soddisfare le esigenze della moderna ricerca sulla biologia molecolare. Quindi, la scoperta del fattore stimolante le colonie di macrofage (m-CSF) e dell’attivatore del recettore per il ligando del fattore nucleare-κB (RANKL) rende l’osteoclastogenesi più facile^9,10,11e il metodo di utilizzo di m-CSF e RANKL per stimolare direttamente la formazione di degli osteoclasti è ampiamente usato in tutto il mondo. Tuttavia, ci sono ancora alcuni dettagli nella metodologia che devono essere migliorate.

Attualmente, il metodo di coltura degli osteoclasti più comunemente usato, come descritto da Marino et al.¹² e Pei et al.¹³, spesso richiede la rimozione del tessuto circostante intorno all’osso e utilizza un ago sterilizzato per lavare la cavità del midollo con supporti completati. Ci sono alcuni inconvenienti a questo processo, compreso il fatto che (1) la rimozione del tessuto circostante intorno all’osso richiede molto tempo e grande tecnica chirurgica, (2) le ossa sono fragili e possono portare a deflusso del midollo osseo, (3) la cavità del midollo osseo potrebbe essere troppo piccolo per lavare, e (4) c’è il rischio di lesioni dell’ago. Per evitare questi problemi, centrifugheremo i tubi contenenti le ossa per il midollo osseo invece di lavare l’ago al midollo osseo. Qui, introduciamo un metodo stabile e sicuro che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale. Insieme all’uso della centrifugazione con gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati in vitro.

Protocol

Tutti i metodi che coinvolgono gli animali qui descritti sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) dell’Università di medicina cinese di Nanchino. 1. impostazione del Setup Preparare diversi puntali per pipette da 1 mL longitudinalmente tagliati (1 cm) e diversi provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Mettere i puntali per pipette e le provette per microcentrifuga a 103 kPa e 121 ° c per 20 minuti e assicurarsi che siano sterili. …

Representative Results

Lo scopo del protocollo era quello di isolare e purificare un gran numero di precursori degli osteoclasti convenientemente e indurre osteoclasti con successo. Completando con M-CSF e RANKL, osteoclasti giganti sono stati osservati nei giorni 5 – 6. La formazione di osteoclasti è stata identificata con successo dalla colorazione TRAP (Figura 1a). Le cellule grandi e viola sono state considerate come cellule trappola-positive con nuclei multipli (tipicamente…

Discussion

La capacità di ottenere e studiare osteoclasti in vitro è un’abilità critica e fondamentale per qualsiasi ricercatore che desideri studiare il metabolismo osseo, che può aiutare a comprendere i meccanismi delle malattie che assorbono le ossa e sviluppare nuovi agenti terapeutici. Il presente studio ha descritto un protocollo con alcune modifiche basate su metodi precedenti.

Utilizzando puntali per pipette e provette per microcentrifuga per ottenere il midollo osseo, ha ridotto in gran part…

Materials

Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Automatic Hard Tissue Slicer	Lecia	RM2265
Bovine femoral bone			Purchased by ourselves
Cell Incubator	Heraus	BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum	Sarana	s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Hard Tissue Grinders	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Inverted Phase Contrast Microscope	Olympus	CKX31
Inverted Fluorescence Microscope	Lecia	DMI-3000
MEM, no Glutamine	Gibco	11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor	Bioss	bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF	PeproTech	400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand	PeproTech	400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer	Absin	abs47014932
Scanning Electron Microscopy	FEI	Quanta 200
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89649