Изоляция, очищение, и дифференциация Остеокласт прекурсоров из костного мозга крысы
Summary
Остеокласты представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из моноцитов-макрофагов линии гемопоэтических стволовых клеток. Этот протокол описывает, как изолировать клетки костного мозга, чтобы получить большое количество остеокластов при одновременном снижении риска несчастных случаев, найденных в традиционных методах.
Abstract
Остеокласты большие, многоядерные, и кости-расрезные клетки моноцитов-макрофагов линии, которые формируются путем слияния моноцитов или прекурсоров макрофагов. Чрезмерное резорбция кости является одним из наиболее значимых клеточных механизмов, ведущих к остеолитических заболеваний, включая остеопороз, периодонтит, и перипротеза остеомолиза. Основной физиологической функцией остеокластов является поглощение как гидроксиапатитового минерального компонента, так и органической матрицы костной ткани, генерирующей характерный вид резорбции на поверхности костей. Есть относительно мало остеокластов по сравнению с другими клетками в организме, особенно у взрослых костей. Недавние исследования были посвящены тому, как получить более зрелые остеокласты за меньшее время, что всегда было проблемой. В лабораториях в целях получения более зрелых остеокластов были разработаны некоторые усовершенствования в методах изоляции и культуры. Здесь мы вводим метод, который изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционной процедурой, используя специальное и простое устройство. С использованием градиента центрифугирования плотности, мы получаем большое количество полностью дифференцированных остеокластов из крысиного костного мозга, которые определены классическими методами.
Introduction
Костный гомеостаз – это сложный физиологический процесс, регулируемый остеокластами костной ткани и образующие костные остеобласты1. Равновесие между остеобластным и остеокластов активностью при посредничестве остеобластов и остеокластов, соответственно, крайне важно для поддержания здоровья костей и гомеостаза, поскольку возмущения в костном гомеостазе могут приводить к заболеваниям костей, таким как аномальный рост костей или потеря плотности костной ткани. Как уникальные кости-резорбции, остеокласты имеют важное значение при заболеваниях, связанных с аномальной костной разрушения, включая остеопороз, периодонтит, и перипротеза остеолиза2,3.
Развитие Остеокласт в основном делится на два этапа. Методы, созданные Бойде et al.4 и камерами et al.5 , составили первый этап в 1980-х годах. Они получили относительно обильные остеокласты из костей новорожденных животных, что является быстрым периодом реконструкции. Остеокласты выпускаются путем фрагментации и перемешивания костей в специальной среде. Тем не менее, клетки, полученные этим методом, являются низкими по количеству и чистоте. Вторым этапом было развитие культур дальнего действия остеокластов, использование клеток гематопоэтических родословных, полученных из костного мозга6. Цитокинов, таких как 1а, 25-дигидроксивитамин D3, простагландин Е2 (PGE-2) и паратиреоидный гормон (ПТГ), которые добавляются в среду культуры, действуют через систему остеобластов/стромальных клеток, чтобы стимулировать образование остеокластов7,8 . Однако чистота и количество остеокластов, полученных этим методом, не могут удовлетворить потребности современной молекулярной биологии. Затем, открытие макрофагов колонии-стимулирующий фактор (м-КСФ) и рецептор активатора для ядерного фактора-Клаб лиганда (rankl) сделать остеокластогенез легче9,10,11, и метод использования м-КСФ и RANKL непосредственно стимулировать образование остеокластов широко используется во всем мире. Тем не менее, есть еще некоторые детали в методологии, которые должны быть улучшены.
В настоящее время наиболее часто используемый метод остеокластов, описанный Марино et al.12 и пей et al.13, часто требует удаления окружающих тканей вокруг кости и использует стерилизованные иглы для смыва костного мозга с Завершенные средства массовой информации. Есть некоторые недостатки этого процесса, в том числе тот факт, что (1) удаление окружающих тканей вокруг кости требует много времени и большой хирургической техники, (2) кости хрупкие и может привести к оттоку костного мозга, (3) полость костного мозга может быть слишком крошечные, чтобы флеш, и (4) есть риск травмы Stick иглы. Чтобы избежать этих проблем, мы центрифугирования труб, содержащих кости для костного мозга, а не иглы промывка костного мозга. Здесь мы представляем стабильный и безопасный метод, который изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционной процедурой. Вместе с использованием градиента центрифугирования плотности мы получаем большое количество полностью дифференцированных остеокластов в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность получать и изучать остеокласты в пробирке является критическим и фундаментальным навыком для любого исследователя, желающего изучать костный метаболизм, что может помочь понять механизмы костной поглощающей болезни и развить новые терапевтические агенты. В настоящем ис?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81473692) к Юн мА. Авторы благодарят весь коллектив медицинского исследовательского центра первого колледжа клинической медицины в Нанкинском университете китайской медицины.
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
Referências
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
