العزلة ، تنقيه ، والتمايز من السلائف العظمية من نخاع العظم الفئران
Summary
العظم والعظام هي الانسجه الخاصة الضامة الكريات العظمية المشتقة من سلاله أحاديه الضامة من الخلايا الجذعية التي تكون الدم. يصف هذا البروتوكول كيفيه عزل خلايا نخاع العظم بحيث يتم الحصول علي كميات كبيره من العظم العظمي مع الحد من مخاطر الحوادث الموجودة في الطرق التقليدية.
Abstract
العظم والعظام هي الخلايا الكبيرة ، نوى ، والعظم-ارتشاف السلالة الاحاديه الضامة التي تتشكل من خلال انصهار البويضات الاحاديه أو السلائف الضامة. ارتشاف العظم المفرط هو واحد من أهم أليات الخلوية التي تؤدي إلى امراض العظم ، بما في ذلك هشاشة العظام ، التهاب اللثة ، وانحلال العظم الاصطناعي. تتمثل الوظيفة الفسيولوجية الرئيسية للعظام في امتصاص كل من مكون هيدروكسيباتيت المعدني والمصفوفة العضوية للعظام ، مما يولد مظهر الارتشاف المميز علي سطح العظام. هناك عدد قليل نسبيا من العظم العظمي بالمقارنة مع الخلايا الأخرى في الجسم ، وخاصه في عظام الكبار. وقد ركزت الدراسات الاخيره علي كيفيه الحصول علي أكثر نضجا العظام في وقت اقل ، والتي كانت دائما مشكله. وقد تطورت العديد من التحسينات في تقنيات العزلة والثقافة في المختبرات من أجل الحصول علي أكثر نضجا العظام. هنا ، ونحن نقدم طريقه التي يعزل نخاع العظم في وقت اقل ومع اقل جهد مقارنه مع الاجراء التقليدي ، وذلك باستخدام جهاز خاص وبسيط. مع استخدام طرد التدرج الكثافة ، ونحن الحصول علي كميات كبيره من العظام متمايزة تماما من نخاع العظم الفئران ، والتي يتم تحديدها بواسطة الأساليب الكلاسيكية.
Introduction
التوازن العظام هو عمليه الفسيولوجية المعقدة التي ينظمها العظم resorbing العظام والعظام تشكيل عظم1. التوازن بين النشاط العظمي والعظام التي توسطت من خلال عظم والعظم ، علي التوالي ، هو ضروري للغاية للحفاظ علي صحة العظام والتوازن ، وذلك لان الاضطرابات في التوازن العظام قد يؤدي إلى امراض العظام ، مثل كما غير طبيعي نمو العظام أو فقدان كثافة العظام. كخلايا ارتشاف العظام الفريدة من نوعها ، فان العظم الكبدي مهم في الامراض المتعلقة بتدمير العظام غير الطبيعي ، بما في ذلك ترقق العظم ، والتهاب اللثة ، وانحلال العظم الاصطناعي2،3.
يتم تقسيم تطور الثقافة العظمية بشكل رئيسي إلى مرحلتين. وقد شكلت الأساليب التي وضعتها Boyde et al.4 والدوائر وآخرون5 المرحلة الاولي في الثمانينات من القرن الماضي. انها حصلت علي وفره نسبيا العظم من عظام المواليد الجدد ، والتي هي فتره أعاده عرض السريع. يتم الإفراج عن العظم عن طريق تفتيت وتحريك العظام في وسط خاص. ومع ذلك ، فان الخلايا التي تم الحصول عليها بواسطة هذا الأسلوب منخفضه الكمية والنقاء. وكانت المرحلة الثانية تطوير الثقافات طويلة المدى للتشكيل العظمي ، وذلك باستخدام خلايا السلالة المكونة للدم المستمدة من نخاع العظم6. السايتوكينات ، مثل 1α ، 25-ديهيدروكسيفيتامين D3 ، بروستاستارين E2 (pge-2) ، وهرمون الغدة الدرقية (pge) ، والتي تضاف إلى الوسط الثقافي ، والعمل من خلال نظام الخلايا العظمة/اللحمية لتحفيز تشكيل العظم7،8 . ومع ذلك ، فان نقاء وكميه العظام التي يتم الحصول عليها بواسطة هذه الطريقة لا يمكن ان تلبي احتياجات البحوث البيولوجيا الجزيئية الحديثة. ثم ، اكتشاف عامل التحفيز مستعمره الضامة (م-السائل الدماغي الشوكي) والمنشط مستقبلات لعامل النووية-κb يجند (rankl) جعل العظمية أسهل9،10،11، وطريقه استخدام M-السائل الدماغي الشوكي RANKL لتحفيز مباشره تشكيل العظم يستخدم علي نطاق واسع في جميع انحاء العالم. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض التفاصيل في المنهجية التي تحتاج إلى تحسين.
وفي الوقت الحالي ، فان طريقه الاستزراع العظمي الأكثر استخداما ، كما وصفتها مارينو وآخرون12 و Pei et al.13، غالبا ما تتطلب أزاله الانسجه المحيطة حول العظم وتستخدم ابره معقمه لمسح تجويف النخاع مع وسائل الاعلام المكتملة. هناك بعض العيوب لهذه العملية ، بما في ذلك حقيقة ان (1) أزاله الانسجه المحيطة حول العظام يتطلب الكثير من الوقت والتقنية الجراحية كبيره ، (2) العظام هشه ويمكن ان يؤدي إلى تدفق نخاع العظم ، (3) قد يكون تجويف نخاع العظم صغيره جدا لدافق ، و (4) هناك خطر أصابه ابره العصا. لتجنب هذه المشاكل ، ونحن الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي علي العظام لنخاع العظم بدلا من ابره-تنظيف نخاع العظم. هنا ، ونحن نقدم طريقه مستقره وأمنه التي تعزل نخاع العظم في وقت اقل ومع اقل جهد مقارنه مع الإجراءات التقليدية. مع استخدام طرد التدرج الكثافة ، ونحن الحصول علي كميات كبيره من العظام متمايزة تماما في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة علي الحصول علي ودراسة العظم الكبدي في المختبر هو مهارة حاسمه وأساسيه لأي باحث يرغب في دراسة استقلاب العظام ، والتي قد تساعد علي فهم أليات الامراض التي تمتص العظام وتطوير العوامل العلاجية الجديدة. وقد وصفت هذه الدراسة بروتوكولا مع بعض التعديلات استنادا إلى الأساليب السابقة.
<p class=…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81473692) إلى يونغ ما. ويشكر المؤلفون جميع موظفي مركز البحوث الطبية في الكلية الاولي للطب السريري في جامعه نانجينغ للطب الصيني.
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
Referências
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
