Isolering, rensning og differentiering af Osteoklastprækursorer fra rotte knoglemarv

Summary

Osteoklaster er vævsspecifikke makrofag polykaryoner afledt af monocyte-makrofag-Lineage af hæmatopoietiske stamceller. Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer knoglemarvsceller, så der opnås store mængder osteoklaster, samtidig med at risikoen for ulykker, der findes i traditionelle metoder, mindskes.

Abstract

Osteoklaster er store, fler umægede og knogle resorberende celler i monocyte-makrofag-Lineage, der dannes ved fusion af monocytter eller makrofag-prækursorer. Overdreven knogleresorption er en af de mest betydningsfulde cellulære mekanismer, der fører til osteolytiske sygdomme, herunder osteoporose, periodontitis og periprostetisk osteolyse. De vigtigste fysiologiske funktion af osteoklaster er at absorbere både hydroxyapatit mineral komponent og den organiske matrix af knogle, genererer den karakteristiske resorption udseende på overfladen af knogler. Der er relativt få osteoklaster sammenlignet med andre celler i kroppen, især i voksne knogler. Nylige undersøgelser har fokuseret på, hvordan man får mere modne osteoklaster på mindre tid, hvilket altid har været et problem. Flere forbedringer i isolation og kultur teknikker har udviklet sig i laboratorier for at opnå mere modne osteoklaster. Her introducerer vi en metode, der isolerer knoglemarv på mindre tid og med mindre indsats i forhold til den traditionelle procedure, ved hjælp af en særlig og enkel anordning. Med brugen af densitets gradient centrifugering, vi får store mængder af fuldt differentierede osteoklaster fra rotte knoglemarv, som er identificeret ved klassiske metoder.

Introduction

Knogle homøostase er en kompleks fysiologisk proces, der reguleres af knogle resorbing osteoklaster og knogledannende osteoblaster¹. En balance mellem osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet medieret gennem osteoblaster og osteoklaster, henholdsvis, er meget vigtigt for at opretholde knogle sundhed og homøostase, fordi forstyrrelser i knogle homøostase kan føre til knoglesygdomme, såsom som unormal knoglevækst eller tab af knogletæthed. Som unikke knogleresorption celler, osteoklaster er vigtige i sygdomme relateret til unormal knogle ødelæggelse, herunder osteoporose, periodontitis, og periprosthetic osteolyse^2,3.

Udviklingen af en osteoklast kultur er hovedsageligt opdelt i to etaper. De metoder, der blev fastlagt af Boyde et al.⁴ og Chambers et al.⁵ , bestod af første etape i 1980 ‘ erne. De opnåede relativt rigelige osteoklaster fra knoglerne hos nyfødte dyr, som er den hurtige remodeling periode. Osteoklaster frigives ved at fragmentere og omrøre knoglerne i et særligt medium. Men, cellerne opnået ved denne metode er lav i mængde og renhed. Den anden fase var udviklingen af langtrækkende kulturer af osteoklast dannelse, ved hjælp af hæmatopoietiske Lineage celler afledt af knoglemarv⁶. Cytokiner, såsom 1α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2) og parathyreoideahormon (pth), som tilsættes til dyrkningsmediet, virker gennem systemet af osteoblaster/stromale celler for at stimulere osteoklast-dannelsen på^7,8 . Den renhed og mængde af osteoklaster, der opnås ved denne metode, kan imidlertid ikke opfylde behovene i forbindelse med moderne molekylær biologi forskning. Derefter, opdagelsen af makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator for nuklear faktor-κb ligand (rankl) gøre osteoclastogenesis lettere^9,10,11, og metoden til at bruge M-CSF og RANKL til direkte at stimulere osteoklast dannelse er almindeligt anvendt rundt om i verden. Der er dog stadig nogle detaljer i den metodologi, der skal forbedres.

I øjeblikket kræver den hyppigst anvendte osteoklast kultur metode, som beskrevet af Marino et al.¹² og Pei et al.¹³, ofte fjernelse af det omgivende væv omkring knoglen og bruger en steriliseret nål til at skylle knoglemarv hulrummet med afsluttede medier. Der er nogle ulemper ved denne proces, herunder det faktum, at (1) fjernelsen af det omgivende væv omkring knoglen kræver meget tid og stor kirurgisk teknik, (2) knoglerne er skrøbelige og kan føre til knoglemarv udstrømning, (3) knoglemarvs hulen kan være for lille til at skylle, og (4) der er risiko for nålestikskade. For at undgå disse problemer centrifugeres de rør, der indeholder knoglerne til knoglemarv, i stedet for nåle skylning af knoglemarven. Her introducerer vi en stabil og sikker metode, der isolerer knoglemarv på mindre tid og med mindre indsats i forhold til den traditionelle procedure. Sammen med brugen af densitets gradient centrifugering, vi får store mængder af fuldt differentierede osteoklaster in vitro.

Protocol

Alle de metoder, der involverer de dyr, der er beskrevet her, er godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Nanjing University of Chinese Medicine. 1. opsætning af Der tilberedes flere længde-og udskåret 1 mL pipettespidser (1 cm) og flere 1,5 mL mikrocentrifugerings glas. Sæt pipette spidserne og mikrocentrifugerings rørene på 103 kPa og 121 °C i 20 minutter, og sørg for, at de er sterile. Forbered en æske med is og flere sterile re…

Representative Results

Formålet med protokollen var at isolere og rense et stort antal osteoklast prækursorer bekvemt og inducere osteoklaster med succes. Ved at supplere med M-CSF og RANKL, blev gigantiske osteoklaster set på dag 5 – 6. Dannelsen af osteoklaster blev med held identificeret ved TRAP-farvning (figur 1a). Store og lilla celler blev betragtet som TRAP-positive celler med flere kerner (typisk ≥ tre kerner). Gennem denne metode, det var typisk at opnå 800 osteok…

Discussion

Evnen til at opnå og studere osteoklaster in vitro er en kritisk og grundlæggende færdighed for enhver forsker, der ønsker at studere knogle metabolisme, som kan hjælpe med at forstå mekanismerne i knogle absorberende sygdomme og udvikle nye terapeutiske midler. Den foreliggende undersøgelse beskrev en protokol med nogle ændringer baseret på tidligere metoder.

Ved at bruge pipettespidser og mikrocentrifugerings slanger til at opnå knoglemarv reducerede det i høj grad operationstiden…

Materials

Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Automatic Hard Tissue Slicer	Lecia	RM2265
Bovine femoral bone			Purchased by ourselves
Cell Incubator	Heraus	BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum	Sarana	s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Hard Tissue Grinders	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Inverted Phase Contrast Microscope	Olympus	CKX31
Inverted Fluorescence Microscope	Lecia	DMI-3000
MEM, no Glutamine	Gibco	11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor	Bioss	bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF	PeproTech	400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand	PeproTech	400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer	Absin	abs47014932
Scanning Electron Microscopy	FEI	Quanta 200
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89649