Os osteoclastos são polykaryons tecido-específicos do macrófago derivados da linhagem do monocyte-macrófago de pilhas de haste hematopoietic. Este protocolo descreve como isolar pilhas da medula de modo que as grandes quantidades de osteoclastos sejam obtidas ao reduzir o risco de acidentes encontrados em métodos tradicionais.
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Artigo de método
Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os osteoclastos são grandes, multinucleados, e células de reabsorção óssea da linhagem monócitos-macrófago que são formadas pela fusão de monócitos ou precursores de macrófago. O reabsorção excessivo do osso é um os mecanismos celulares os mais significativos que conduzem às doenças osteolytic, incluindo a osteoporose, o periodontitis, e o osteolysis periprotético. A principal função fisiológica dos osteoclastos é absorver tanto o componente mineral de hidroxiapatita quanto a matriz orgânica do osso, gerando a aparência característica de reabsorção na superfície dos ossos. Existem relativamente poucos osteoclastos em comparação com outras células do corpo, especialmente em ossos adultos. Estudos recentes têm se concentrado em como obter mais osteoclastos maduros em menos tempo, o que sempre foi um problema. Várias melhorias nas técnicas de isolamento e cultura desenvolveram-se em laboratórios, a fim de obter mais osteoclastos maduros. Aqui, apresentamos um método que isola a medula óssea em menos tempo e com menos esforço em comparação com o procedimento tradicional, utilizando um dispositivo especial e simples. Com o uso da centrifugação do inclinação da densidade, nós obtemos grandes quantidades de osteoclastos inteiramente diferenciados da medula do osso do rato, que são identificados por métodos clássicos.
Introdução
A homeostase óssea é um processo fisiológico complexo que é regulado por osteoclastos de reabsorção óssea e osteoblastos de formação óssea1. Um equilíbrio entre a atividade osteoblástica e osteoclástica mediada por osteoblastos e osteoclastos, respectivamente, é altamente essencial para manter a saúde óssea e a homeostase, pois as perturbações na homeostase óssea podem levar a doenças ósseas, tais como crescimento ósseo anormal ou perda da densidade óssea. Como células únicas de reabsorção óssea, os osteoclastos são importantes em doenças relacionadas à destruição óssea anormal, incluindo osteoporose, periodontite e osteólise periprotética
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Protocolo
Todos os métodos que envolvem os animais aqui descritos são aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de medicina chinesa de Nanjing.
1. configuração
- Prepare várias pontas de pipeta de 1 mL longitudinalmente cortadas (1 cm) e vários tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Põr as pontas da pipeta e os tubos do microcentrifugador em 103 kPa e em 121 ° c por 20 minutos e assegure-se de que estejam estéreis.
- Prepare uma caixa de gelo e vários pratos estéreis para preservar os tecidos isolados durante o procedimento de isolamento.
2. preparação do meio....
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Resultados
A finalidade do protocolo era isolar e purificar grandes números de precursores do osteoclast convenientemente e induzir osteoclastos com sucesso. Suplementando com o M-CSF e o RANKL, os osteoclastos gigantes foram vistos nos dias 5 – 6. A formação de osteoclastos foi identificada com sucesso pela coloração TRAP (Figura 1a). As pilhas grandes e roxas foram consideradas como pilhas armadilha-positivas com núcleos múltiplos (tipicamente ≥ três núcleos). Através.......
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Discussão
A capacidade de obter e estudar osteoclastos in vitro é uma habilidade crítica e fundamental para qualquer pesquisador que deseje estudar o metabolismo ósseo, o que pode ajudar a compreender os mecanismos de doenças absorventes de ossos e desenvolver novos agentes terapêuticos. O presente estudo descreveu um protocolo com algumas modificações com base em métodos anteriores.
Usando pontas da pipeta e os tubos do microcentrifugador para obter a medula, reduziu pela maior parte o tempo da operaçã.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81473692) para Yong ma. Os autores agradecem a todos os funcionários do centro de investigação médica da primeira faculdade de medicina clínica na Universidade de Nanjing de medicina chinesa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de fosfatase ácida, lecócitos (TRAP) | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Fatiador automático de tecidos duros | Lecia | RM2265 | |
| Osso | Comprado por nós mesmos | ||
| Incubadora de células | Heraus | BB16 / BB5060 | |
| Soro bovino fetal | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Cabra Anti-Coelho IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Moedores de Tecidos Duros | Lecia | SP-2600 | |
| Kit Histopaco | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Tubo centrífugo silicificado e solução de separação de células |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Microscópio de Contraste de Fase Invertida | Olympus | CKX31 | |
| Microscópio de fluorescência invertida | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, sem glutamina | Gibco | 11090-081 | |
| Penicilina-estreptomicina, Gibco | líquido 15140122 | ||
| receptor anti-calcitonina de coelho | Bioss | bs-0124R | |
| Rato recombinante M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Rato recombinante sRANK Ligante | PeproTech | 400-30 | |
| Tampão de Lise de Glóbulos Vermelhos | Absin | abs47014932 | |
| Microscopia Eletrônica de Varredura | FEI | Quanta 200 | |
| Azul de Toluidina | Sigma-Aldrich | 89649 |
Referências
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12)....
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Reimpressões e permissões
