Summary
在这里, 我们提出了一个高度可访问的协议, 用于评估细胞在人类滋养细胞中的运动使用三个体外检测: 划痕试验, 转井入侵试验, 细胞增殖试验。
Abstract
细胞运动是胎盘发育和早孕过程中滋养细胞的重要特性。适当的滋养细胞迁移和入侵的意义表现在妊娠期疾病, 如先兆子痫和宫内生长限制, 这与不充分的滋养细胞入侵的母体血管。不幸的是, 我们对胎盘从迁移滋养细胞中发育的机制的理解是有限的。通过划痕法进行细胞迁移的体外分析是识别调节滋养细胞迁移能力的因素的有用工具。然而, 仅此检测并不能定义可能导致细胞迁移改变的细胞变化。该协议描述了三种不同的体外检测, 这是共同用于评估滋养细胞的运动: 划痕试验, 入侵试验, 和增殖试验。这里描述的协议也可以修改, 用于其他细胞系, 以量化细胞在刺激下的运动。这些方法使调查人员能够确定有助于细胞移动的个别因素, 并对细胞迁移明显变化的潜在机制进行彻底审查。
Introduction
胎盘发育是建立妊娠的关键一步, 影响孕产妇和胎儿的健康。然而, 这一过程发生的机械基础并不完全了解。细胞迁移是一个重要的生物过程, 有助于怀孕期间胎盘的建立和功能。囊胚植入后, 滋养细胞分化为绒毛滋养细胞, 覆盖绒毛膜的表面, 参与气体和营养交换, 以及从绒毛中迁移出来的外生滋养细胞 (evt)并侵入母体和血管 1.evt 的迁移对于重塑产妇螺旋动脉和建立子宫胎盘循环以支持胎儿生长至关重要 2。妊娠期间滋养细胞入侵不足会导致胎盘发育异常, 并可能导致妊娠并发症, 如先兆子宫炎、妊娠期高血压、子宫内生长受限和早产3, 4. 我的工作是什么？因此, 了解影响滋养细胞运动的因素对于确定正常胎盘所需的途径至关重要。
滋养细胞迁移是由一个复杂的信号分子网络控制的, 包括生长因子、细胞因子、激素和血管生成因子5。由于在体内研究胎盘的局限性, 利用永生人类滋养细胞系进行体外检测对于确定导致滋养细胞运动的因素至关重要。划痕和入侵检测已被广泛用于定量评估单个分子在滋养细胞迁移中的作用 6,7, 8.然而, 虽然同时研究细胞入侵的变化可能会导致迁移的变化, 但这两种检测并没有考虑到可能导致细胞迁移率改变的其他机制。例如, 细胞增殖率的降低可能会导致可供迁移的细胞减少。
在这里, 我们描述了使用划痕、细胞增殖和细胞入侵检测来评估滋养细胞迁移的体外定量方法。在划痕试验中, 在细胞单层中创建一个均匀的伤口, 并通过对伤口内细胞的大小和密度进行自动延时成像来测量细胞的迁移以填补缝隙。细胞增殖分析的基础是计算每个时间点的细胞与已知的细胞起始量的比率。在细胞浸润试验中, 细胞被播种在细胞外基质包膜细胞培养插入室 (如 tranwell) 上, 并计算出通过细胞外基质侵入的细胞数量对趋化剂的反应。
划痕检测是一个简单而有效的工具, 可用于确定不同的环境条件如何影响细胞迁移。增殖和入侵检测随后可用于确定细胞增殖和入侵对细胞迁移总体变化的贡献。这些检测方法总体上提供了对生物过程的可靠测量, 这些过程可能有助于细胞的运动。在所述检测中使用了两个不朽的头三个月滋养细胞细胞系: swan.71 (Swan.71) 和 htr-8/svneo9,10。然而, 这些检测也可以优化用于其他细胞类型, 以识别细胞迁移和入侵的关键模块。
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Protocol
1. 细胞制备
- 将 t-75 瓶中的细胞保持在37°c、5% co2和95% 湿度的标准生长介质中。
请注意:这些实验中使用的细胞是不朽的头三个月滋养细胞细胞系 swa. 71 (Swan.71) 和 htr-8/svneo9,10。ssw.71 细胞被维持在 dmemci-12 中, 辅以10% 的热灭活胎牛血清 (fbs), 1.0 mm 丙酮酸钠、10 mm hepes、0.10 mm mM 非必需氨基酸、100 unitsl 青霉素和100μgml 链霉素。htr-8/svneo 细胞在 rpmi-1640 中得到5% 热灭活 fbs 的补充。 - 让细胞复制, 直到它们达到 90%-100% 的融合。使用无菌组织培养流罩, 从烧瓶中抽吸培养基, 用10毫升无菌的1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗细胞。
- 吸收 pbs, 加入5倍的5毫升 (0.05%)胰蛋白酶 edta 到烧瓶, 以确保细胞被胰蛋白酶覆盖。将烧瓶放置在实验室孵化器中, 保持在37°c、5% co2和95% 的湿度, 直到所有细胞都脱离烧瓶底部 (约 5-10)。
- 在烧瓶中加入10毫升预热生长介质, 以停用色氨酸-edta。
2. 划痕评估
- 在步骤1.4 之后, 将适当数量的细胞播种成一个24孔板, 在48小时内实现100% 的融合。
请注意:它可以执行划痕检测与各种不同的板材布局。伤口制造商工具允许的最大井数是96孔格式。 - 第二天 (在划痕检测的前一天), 将培养基改为酚类自由介质, 并根据需要补充, 包括热灭活、木炭右旋不除的 fbs。
请注意:其他研究建议使用低浓度 fbs 的介质 (例如, 1%)以最大限度地减少细胞增殖, 这可以作为本协议11中的替代方法. - 在划痕检测当天, 通过在每口井的培养基中添加所需的治疗方法, 对细胞进行30分钟的预处理。概述的实验利用了车辆 (1x pbs) 和 100 nm 地塞米松稀释在 1x pbs。
-
要创建均匀的伤口, 请将无菌10μl 移液器吸头放在伤口制造商工具的针脚上。将吸头降低到第一排井中, 沿着伤口制造商的轨道移动板, 直到移液器尖端到达井的另一侧。
- 将板材移回起始位置, 使移液器吸头能够不断接触板的底部, 以确保在井径上有一个恒定的伤口。取出并更换无菌10μl 移液器吸指头, 并将吸头降低到下一排井中。
- 重复步骤 2.4, 直到所有油井被划伤。
请注意:如果伤口制造商工具不可用, 可以通过手动刮刮井中心与10μl 移液器尖端造成伤口。 - 小心吸气介质, 用 1x pbs 轻轻清洗细胞两次。最后清洗后, 添加补充酚红色自由, 剥离或低 fbs 介质所需的处理或车辆 (指示步骤 2.3)。
请注意:htr-8/svneo 细胞应使用补充酚红色介质清洗, 因为用 1x pbs 清洗会导致细胞分离。 - 将装有划伤井的24孔板放置在保持在37°c、5% 二氧化碳和95% 湿度的实验室孵化器中的自动延时成像仪 (见材料表) 中。图像根据需要定期井, 以使细胞完成伤口愈合 (例如, 每 2小时 72小时)。
- 通过与自动延时成像仪相关的软件计算伤口密度和宽度 (见材料表)。若要计算伤口大小相对于开始伤口大小的百分比变化, 请在时间0将伤口宽度设置为100%。将每个后续时间点中的伤口大小除以时间0时的伤口大小, 并乘以100以获得百分比 (图 1)。
3. 入侵检测
- 按照步骤 1.4, 将适当数量的细胞播种成6孔板, 使细胞在48小时内达到90% 的融合. 将细胞保持在实验室孵化器中设置为37°c、5% co 2 和95% 的湿度。
- 第二天, 将介质改为酚红色自由介质, 并根据需要补充, 包括热灭活、木炭右旋不含 fbs。
请注意:细胞可以在这个时候进行预处理, 这取决于实验设计。 - 此时, 将 10 mgml 细胞外基质的小瓶 (见材料表) 放在冰上, 让它在冰箱里解冻一夜。
- 第二天, 在使用细胞外基质之前, 将24孔板、细胞培养插入物、微离心管和移液器吸头放置在冰箱 (4°c) 中至少 2小时, 从而提供冷却前入侵检测材料。
- 在组织培养罩中使用冷冻剂, 将 10 mgmml 细胞外基质 1: 1 稀释, 并含有无酚红色、无血清的介质, 最终浓度为 5 mg/ml。
请注意:总是保持在冰上的股票和稀释的细胞外基质。细胞外基质与培养基的比例可以根据检测中使用的细胞系的特性进行调整。 - 在组织培养罩中使用冷冻剂, 在放置在24孔板中的刀片 (见材料表) 中添加100μl 稀释的细胞外基质。确保矩阵是水平的, 没有任何气泡。将含有基质涂层刀片的24孔板置于37°c 的孵化器中, 使基质变硬。
- 为了为入侵检测准备细胞, 用 1x pbs 的1毫升清洗细胞, 吸入 pbs, 并在每口井中添加500μl 的1x 色氨酸 edta。将6孔板放置在实验室孵化器中, 保持在37°c、5% co2和95% 的湿度下, 直到所有细胞都脱离了板的底部。
- 一旦细胞分离, 在胰蛋白酶细胞的每口井中加入500μl 的无酚红色无血清介质。
- 将 1, 000μl 的分离细胞转移到微离心管中, 在4°c 时, 在 400 x克的情况下旋转5分钟。
- 在无酚红色无血清介质中吸收吸入物培养基并重新悬浮细胞 (体积将取决于细胞的浓度)。使用自动单元计数器对细胞进行计数 (见材料表), 并调整细胞悬浮液的体积, 最终浓度为每毫升 5x 10 5个细胞。
请注意:血细胞仪和显微镜也可用于计数细胞。 - 在将用于入侵检测的24井板的井中加入600μl 的完整生长介质。
请注意:在井 (下腔) 的完整生长介质中可以添加额外的趋化剂或处理方法。概述的实验将车辆 (1x pbs) 或 100 nm 地塞米松在 1x pbs 中稀释到下腔。 - 将预涂层插入物放入每个含有完整生长介质的井中, 用于入侵检测。然后在每个预涂膜细胞插入物 (上腔) 的顶部添加200μl 的细胞, 总共为 1 x 105 细胞。
请注意:作为此检测的负对照, 可在上腔中添加同等数量的无酚红色无血清介质 (无细胞)。 - 将24孔板放置在实验室孵化器中, 保持在37°c、5% co2和95% 湿度24小时。
请注意:24小时潜伏期针对不朽的头三个月滋养细胞进行了优化, 可能需要进一步测试, 以确定其他细胞系所需的潜伏期。 - 经过隔夜孵育, 从上腔和下腔吸入剩余的培养基, 而不会干扰细胞外基质。然后, 用棉签小心地从插入物的上半部分取出细胞外基质和未入侵的细胞, 根据需要擦拭多次细胞外基质。
- 用 1x pbs 清洗每个插入的 3x, 并在井的上腔和下腔中添加 pbs。每次清洗后的渴望 pbs。
- 将插入物放入100% 冰凉甲醇中 30分钟, 在4°c 下固定电池连接到刀片上。用 1x pbs 清洗刀片 3倍, 并在最后清洗后取出 pbs。在20% 的乙醇中, 用0.2% 的结晶紫罗兰色将附着在刀片上的细胞染色10分钟。
- 用去离子水冲洗 3x, 最后清洗后抽吸去去离子水。
- 风干刀片, 室温下1小时。使用钳子和剃须刀片, 小心地切割刀片的底膜, 并安装在玻璃滑块上, 底部面朝上。允许安装介质在室温下干燥。
- 使用具有20x 目标的光学显微镜, 每个样品至少获得4个独特的入侵细胞图像。计算每个图像中的单元格总数, 并对单元格数进行规范化, 以控制样本和绘制数据 (图 2)。
4. 扩散检测
- 在步骤1.4 之后, 使用自动细胞计数器从烧瓶中计数胰蛋白酶细胞, 并在标准生长介质中以每口 2 x10 5细胞的密度将其种子成6孔板。
- 将细胞放置在实验室孵化器中, 保持在37°c、5% co2和95% 的湿度下4小时或直到细胞粘附。
- 根据需要将介质更换为酚红色自由介质, 包括热灭活、木炭右旋脱除 fbs, 并添加所需的处理。概述的实验增加了车辆 (1x pbs) 或 100 nm 地塞米松稀释在 1x pbs。将6孔板放置在实验室孵化器中, 保持在37°c、5% co2和95% 的湿度。
- 每48小时取出介质, 更换一次新介质和治疗。
- 经过24、48或72小时的处理后, 用 1x pbs 的1毫升清洗细胞, 并在每口井中添加500μl 的胰蛋白酶 edta。将6孔板放入孵化器中, 直到细胞脱离钢板。
- 一旦细胞脱离了板, 加入500μl 的补充酚红色自由介质, 以停用胰蛋白酶。
- 在单独的试管中加入5μl 的胰蛋白酶细胞, 加入5μl 的色氨酸蓝, 然后通过移液混合。
- 使用自动单元格计数器将每个油井中的单元格计数一式两份。
- 在每个时间点平均每个井的单元格数, 并绘制为时间的函数 (图 3)。
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Representative Results
在这些实验中, 采用永生人类头三个月滋养细胞系 sw.71 和 htr-8/svneo 来确定糖皮质激素在滋养细胞迁移中的作用12。在这些实验中使用了糖皮质激素, 因为它们最近被证明可以改变滋养细胞的功能, 尽管可以使用替代治疗方法 12.在所有实验中, 用车辆 (1x pbs) 或 100 nm 的合成糖皮质激素地塞米松 (dex) 对两种细胞系进行了处理。使用自动延时成像系统, 每2小时测量一次伤口密度和大小, 时间为72小时。图 1显示了在不同时间点从划痕分析中获得的图像和结果的示例。提供了两个处理的0、8和18h 时间点的示例图像 (图 1a)。在使用车辆控制 (veh) 或 100 nm dex 处理的样品中, 伤口密度和伤口大小会随着时间的推移而绘制出来 (图 1 b)。dex 治疗降低了伤口密度和创面大小所决定的伤口闭合率, 表明糖皮质激素抑制了头三个月滋养细胞的细胞迁移。
图 2显示了入侵检测后插入的细胞培养的图像示例。用 veh 或 100 nm dex 治疗细胞24小时。利用每个复制的四个独特的视场, 对每次治疗的四个独立复制单元进行计数。糖皮质激素治疗减少了细胞的侵袭性, 如入侵细胞数量减少15% 所示。
图 3显示了细胞增殖分析的一个例子。在接受 veh 或 100 nm dex 治疗后, 细胞被计算为24、48和72小时。糖皮质激素治疗减少细胞增殖, 每个时间点的细胞较少就表明了这一点。总体而言, 这些检测表明, 糖皮质激素暴露通过抑制细胞增殖和侵袭, 减少细胞动力。
图 1: 单元划痕检测.(a) 显示 veh-和 dext 治疗的 sv.71 细胞在0、8和18小时处的典型伤口图像。红线表示伤口大小。(b) 用车辆 (veh) 或 100 nm dex 处理的 sw.71 和 htr-8\ svneo 细胞测量了伤口密度和伤口大小。使用自动延时显微镜, 每2小时拍摄一次72小时的照片。数据代表四个独立复制的平均值± sem. 请点击这里查看这个数字的一个更大的版本.
图 2: 细胞入侵检测.用 sw.71 和 HTR-8/SVneo 细胞用车辆 (veh) 或 100 nm dex 处理24小时进行入侵检测。(a) 24小时孵育后静脉和 dex待过细胞入侵检测的代表性图像。插入图像是负控制, 上腔没有添加细胞。以200x 放大倍率拍摄的图像。刻度条是 120μm. (b) 输入单元格被计数, 条形图表示四个独立复制± sem 的归一化平均值. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 细胞增殖检测.用车辆 (veh) 或 100 nm dex 处理的 sw.71 和 HTR-8/SVneo 细胞每24小时使用自动细胞计数器进行一次计数。细胞计数被绘制为至少11个独立复制的平均±sem。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这个程序建立在使用迁移和入侵检测的基础上, 包括细胞增殖率作为一个潜在的贡献者测量的营养细胞运动的差异。一起使用, 这些体外检测是简单而有效的方法, 可用于识别调节滋养细胞迁移的细胞途径。如上所述, 滋养细胞可以用激素、细胞因子、生长因子或其他分子来治疗, 以确定它们对滋养细胞运动的影响。或者, 目标蛋白可能会从细胞中耗尽, 以阐明它们在滋养细胞运动中的功能作用。确定滋养细胞迁移的关键调节器可以更好地了解与胎盘缺陷有关的妊娠并发症的基本机制, 包括先兆子宫炎、宫内生长限制和早产。
此协议中有几个关键步骤是获得准确结果所必需的。由于酚类红在细胞培养基13中使用的浓度下具有雌激素活性, 因此在实验终点使用酚红色游离介质以防止细胞中雌激素受体不受欢迎的激活是非常重要的。在转井侵入试验中, 重要的是要确保细胞外基质是均匀的、水平的, 并利用冷供给来防止基质的过早聚合。在进行细胞增殖和入侵检测时, 必须立即对样本进行计数, 以防止细胞重新粘附到组织培养板上。还应该考虑到, 实验治疗导致的细胞死亡可能会影响所有三种检测的结果。因此, 在评估迁移、入侵和扩散14。这些检测存在一些局限性, 例如, 在细胞单层中创建伤口的过程会导致细胞损伤反应, 而不是混淆细胞迁移过程。此外, 手动刮擦可能会引入不同的实验变异性, 尽管使用伤口制造商工具创建统一的伤口宽度可以部分减轻这一限制。入侵试验的缺点是它是一个端点分析, 并且不容易获得运动的动力学。尽管存在这些限制, 此处描述的检测方法仍以相对低成本提供可重现的定量数据。
这里描述的检测也可以修改, 以测量其他细胞类型的细胞迁移, 尽管这些检测方法不适合于非粘附细胞类型。在划痕分析中, 延时显微镜的成像间隔可以进行调整, 以充分捕捉细胞迁移率的差异。用于活细胞成像的自动化系统可以每15分钟以每15分钟的频率捕捉伤口大小的图像, 至少每30分钟拍摄一次的图像可以拼接在一起, 创建伤口愈合的电影。在入侵分析中, 可根据不同细胞类型的特定侵袭率调整细胞外基质的浓度、种子细胞的总数以及固定和计数细胞之前的孵育时间。在细胞增殖试验中, 可以调整在板上播种的细胞数量和细胞计数的时间点, 以考虑到不同的细胞生长速度。总体而言, 这些检测是灵活且高度可访问的工具, 可用于多种细胞类型, 以确定细胞迁移的基本机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 gil mor 博士提供了 sw.71 细胞。这项研究得到了阿尔伯特·麦肯恩·学者奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).
