मानव पोस्टमार्टम सेरिबैलम में लेजर कैप्चर Microdissected Purkinje कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता आरएनए अलगाव के लिए एक स्टेनलेस प्रोटोकॉल
Summary
यह प्रोटोकॉल लेजर कैप्चर microdissection के माध्यम से मानव पोस्टमार्टम सेरिबैलम से ताजा जमे हुए ऊतकों में Purkinje कोशिकाओं को कल्पना और अलग करने के लिए एक दाग-मुक्त दृष्टिकोण का उपयोग करता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएनए-अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए के पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न करने के लिए है ।
Abstract
लेजर कैप्चर microdissection (LCM) heterogenous ऊतकों से cytologically और/या phenotypically प्रासंगिक कोशिकाओं या क्षेत्रों के संग्रह के लिए अनुमति देता है कि एक लाभप्रद उपकरण है । कब्जा कर लिया उत्पाद प्रोटीन, डीएनए या आरएनए अलगाव के लिए आणविक तरीकों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, गुजाइश मानव मस्तिष्क ऊतक से आरएनए के संरक्षण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है । LCM के लिए मानक दृश्य तकनीक histologic या immunohistochemical के लिए आगे शाही सेना नीचा कर सकते है कि प्रक्रियाओं धुंधलाना की आवश्यकता है । इसलिए, हम पोस्ट-मार्टम मानव मस्तिष्क ऊतक में आरएनए अखंडता के संरक्षण के उद्देश्य से LCM में दृश्य के लिए एक स्टेनलेस प्रोटोकॉल तैयार किया । सेरिबैलम के Purkinje कक्ष अपने आकार और विशिष्ट स्थान के कारण, स्टेनलेस दृश्य के लिए एक अच्छा उंमीदवार है । अनुमस्तिष्क प्रांतस्था अलग परतों है कि कोशिका घनत्व में अलग है, उंहें एक अच्छा आदर्श बनाने के लिए उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी के तहत की पहचान । Purkinje कोशिकाओं बड़े न्यूरॉन्स दाना कोशिका परत के बीच स्थित है, जो छोटे ंयूरॉंस की एक घनी सेलुलर नेटवर्क है, और आणविक परत है, जो कोशिका निकायों में विरल है । इस वास्तुकला के कारण, स्टेनलेस दृश्य का उपयोग संभव है । अंय अंग या सेल सिस्टम है कि इस phenotype नकल भी उपयुक्त होगा । स्टेनलेस प्रोटोकॉल इथेनॉल के साथ ताजा जमे हुए ऊतक तय है और उच्च इज़ाफ़ा प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत सुधार रूपात्मक दृश्य के लिए xylene के साथ लिपिड को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस प्रोटोकॉल अंय निर्धारण विधियों के लिए खाते में नहीं है और विशेष रूप से ताजा जमे हुए ऊतक एक पराबैंगनी (यूवी)-LCM प्रणाली का उपयोग कर कब्जा कर लिया नमूनों के लिए बनाया गया है । यहां, हम खोदी और ताजा जमे हुए पोस्ट-मार्टम मानव अनुमस्तिष्क ऊतक और Purkinje कोशिकाओं यूवी-LCM द्वारा पृथक से आरएनए के शोधन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जबकि बाद में आरएनए-अनुक्रमण के लिए आरएनए गुणवत्ता के संरक्षण । हमारे हाथों में, इस प्रोटोकॉल के रूप में transcriptionalात्मक प्रयोगों के लिए जरूरत के रूप में उच्च आरएनए अखंडता संख्या (≥ 8) के साथ दाग रिएजेंट और पैदावार आरएनए के लिए आवश्यकता के बिना सेलुलर दृश्य के असाधारण स्तर पैदा करता है.
Introduction
लेजर कैप्चर microdissection (LCM) एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण है जो बाद में आणविक रूप से संचालित मूल्यांकन के लिए रोग प्रासंगिक कोशिकाओं के पृथक्करण की अनुमति देता है । इन विषम ऊतक नमूनों में आणविक विश्लेषण का उपयोग और रोग और नैदानिक आंकड़ों के साथ सहसंबंध जैविक अनुसंधान1के शोधों के महत्व का मूल्यांकन करने में एक आवश्यक कदम है । जब आरएनए से जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण, जमे हुए ऊतक वर्गों का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है के रूप में यह आरएनए के उत्कृष्ट गुणवत्ता के लिए अनुमति देता है और साथ ही अधिकतम मात्रा2. यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि उच्च गुणवत्ता और आरएनए की मात्रा आरएनए अनुक्रमण3से सार्थक डेटा के लिए आवश्यक हैं. हालांकि, LCM के लिए ताजा जमे हुए पोस्टमार्टम ऊतक से आरएनए का उपयोग करते समय, आरएनए क्षरण एक बड़ी चुनौती है, क्योंकि यह तुरंत मौत पर होता है और इसकी सीमा ऊतक संग्रह विधि4,5 के साथ जुड़े विभिन्न कारकों द्वारा मध्यस्थता है . जब धुंधला तकनीक histologic विवरण और सेल पहचान की पहचान करने की जरूरत है इसके अलावा, आरएनए क्षरण बढ़ा है । ऐसे hematoxylin & eosin, Nissl दाग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunohistochemistry के रूप में विशेष धुंधला तकनीक, स्ट्रोमा आसपास से कोशिकाओं को अंतर में सहायक हैं, लेकिन शाही सेना नीचा दिखाया गया है और प्रतिलिपि अभिव्यक्ति बदल प्रोफाइल6. इसलिए, हमारी प्रयोगशाला विशेष रूप से Purkinje न्यूरॉन्स के LCM अलगाव के बाद आरएनए अनुक्रमण के प्रयोजनों के लिए पोस्टमार्टम मानव सेरिबैलम में आरएनए को संरक्षित करने के लिए बनाया गया एक स्टेनलेस प्रोटोकॉल बनाया गया है ।
LCM के लिए ताजा जमे हुए ऊतक प्रसंस्करण में, निर्धारण विधि दोनों आरएनए और ऊतक अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं । Formalin निर्धारण रूपात्मक संरक्षण के लिए मानक है, लेकिन पार जोड़ने का कारण बनता है कि आरएनए टुकड़ा और आरएनए प्रवर्धन7के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इथेनॉल निर्धारण आरएनए अलगाव के लिए एक बेहतर विकल्प है, के रूप में यह एक coagulative निर्धारण है कि पार से जोड़ने के लिए प्रेरित नहीं करता है1. ऊतक आकृति विज्ञान के दृश्य को बढ़ाने के लिए, xylene सबसे अच्छा विकल्प है, के रूप में यह ऊतक से लिपिड निकालता है । हालांकि, वहां जब LCM में xylene उपयोग सीमाओं, ऊतकों बाहर शुष्क और लेजर पर कब्जा7पर ऊतक विखंडन के कारण भंगुर हो सकता है के रूप में जाना जाता है । Xylene भी एक अस्थिर विष है और ठीक से एक धुएं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए । फिर भी, xylene को ऊतक दृश्य बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जबकि आरएनए अखंडता8संरक्षण । इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल ७०% इथेनॉल निर्धारण और इथेनॉल निर्जलीकरण के उपयोग के आसपास केंद्रों, रूपात्मक स्पष्टता के लिए xylene मशीन द्वारा पीछा किया ।
यह लेजर आधारित microdissection प्रणालियों के विभिंन प्रकार के नोट के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में वे गति में अलग दिखाया गया है, परिशुद्धता, और आरएनए गुणवत्ता । अवरक्त (IR) लेजर कैप्चर microdissection और पराबैंगनी (यूवी) लेजर microbeam microdissection सिस्टम दोनों उपंयास LCM प्लेटफार्मों कि लगभग समवर्ती8उभरा था । ir-LCM प्रणाली एक “संपर्क प्रणाली” एक पारदर्शी थर्माप्लास्टिक ऊतक अनुभाग पर सीधे रखा फिल्म का उपयोग कर रोजगार, और ब्याज की कोशिकाओं को चुनिंदा एक IR लेजर से ध्यान केंद्रित दालों से फिल्म का पालन करें । वैकल्पिक रूप से, यूवी-LCM प्रणाली एक “गैर संपर्क प्रणाली” जिससे एक केंद्रित लेजर बीम दूर कोशिकाओं या ऊतक में ब्याज की क्षेत्रों में कटौती; दो वर्तमान में उपलब्ध वाणिज्यिक प्लेटफार्मों में विंयास पर निर्भर करता है कि या तो एक औंधा या ईमानदार माइक्रोस्कोप डिजाइन का उपयोग करें, ऊतक एक लेजर प्रेरित दबाव लहर है कि यह गुरुत्वाकर्षण या ऊतक के खिलाफ गुलेल द्वारा एक संग्रह डिवाइस में अधिग्रहण कर लिया है क्रमशः गुरुत्वाकर्षण द्वारा एकत्र की । यूवी-LCM प्रणाली के महत्वपूर्ण लाभ एक बहुत छोटे लेजर बीम व्यास9के कारण गैर संपर्क दृष्टिकोण और अधिक सटीक विच्छेदन के साथ तेजी से सेल अधिग्रहण, संदूषण मुक्त संग्रह शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक यूवी LCM प्रणाली के लिए बनाया गया था और एक IR-LCM प्रणाली में परीक्षण नहीं किया गया है । या तो यूवी LCM प्रणाली डिजाइन में, जब संग्रह टोपी में कोशिकाओं को जमा, एक coverslip है कि माइक्रोस्कोपी के दौरान सेलुलर स्पष्टता को बढ़ाता है के उपयोग के उपयुक्त नहीं है, के रूप में कोशिकाओं को संग्रह टोपी में प्रवेश करने में असमर्थ होगा । इसलिए, ऊतक दृश्य को बढ़ाने के लिए, हम अपारदर्शी संग्रह टोपियां, जो तरल भरा संग्रह टोपियां के खिलाफ यूवी-LCM सिस्टम में सूक्ष्म दृश्य के लिए एक coverslip के रूप में कार्य करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं के उपयोग का परीक्षण किया । तरल भरा संग्रह टोपियां चुनौतीपूर्ण हो सकता है, के रूप में तरल वाष्पीकरण के अधीन है और माइक्रोस्कोप पर काम करते हुए अक्सर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । समय आरएनए स्थिरता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है, के रूप में कब्जा कर लिया ऊतक तुरंत भंग7.
हमारी प्रयोगशाला गुजाइश neuropathologic परिवर्तन के साथ रोगियों के सेरिबैलम में आवश्यक कंपन (एट) और सेरिबैलम के संबंधित neurodegenerative विकारों का अध्ययन । हम सुघड़ परिवर्तन Purkinje कोशिकाओं पर केंद्रित है कि एट मामलों बनाम नियंत्रण, Purkinje कोशिकाओं की एक कम संख्या, वृद्धि हुई वृक्ष प्रतिगमन और axonal परिवर्तन की एक किस्म सहित अंतर का प्रदर्शन किया है, हमें मांगना करने के लिए अग्रणी है कि Purkinje सेल अध… एट रोगजनन10,11,12,13में एक कोर जीवविज्ञान सुविधा है । Transcriptional profile कई neurologic रोगों में इस्तेमाल किया गया है अपक्षयी सेलुलर परिवर्तन के अंतर्निहित आणविक आधार का पता लगाने । हालांकि, ऐसे मस्तिष्क ऊतक क्षेत्रों के रूप में विषम नमूनों से transcriptional प्रोफाइल, अमोघ कम बहुतायत टेप की अभिव्यक्ति और/या आणविक परिवर्तन है कि प्रभावित की एक छोटी आबादी में ही हो का पता लगाने कम कर सकते है कक्ष, जैसे अनुमस्तिष्क प्रांतस्था में Purkinje कक्ष । उदाहरण के लिए, Purkinje कोशिकाओं को काफी अनुमस्तिष्क प्रांतस्था में प्रचुर मात्रा में granules कोशिकाओं द्वारा लगभग 1:3000 से अधिक संख्या में हैं; इस प्रकार, प्रभावी ढंग से लक्षित करने के लिए अपने transcriptome इन ंयूरॉंस की विशिष्ट अलगाव की आवश्यकता है । अनुमस्तिष्क प्रांतस्था अलग परतों है कि कोशिका घनत्व और कोशिका के आकार में अलग से delineated है । इस सेलुलर वास्तुकला डाई युक्त दाग एजेंट के बिना एक ताजा जमे हुए ऊतक नमूने में कल्पना करने के लिए आदर्श है । सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल भी अंय प्रकार के ऊतक है कि समान विशिष्ट ऊतक संगठन है के लिए लागू किया जा सकता है ।
यह प्रोटोकॉल मानव पोस्टमार्टम सेरिबैलम में Purkinje सेल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विशेष रूप से काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था. कई प्रोटोकॉल निर्धारण, धुंधला दृश्य और दोनों आईआर-और यूवी-LCM के प्रयोजनों के लिए ऊतकों के कई प्रकार की आरएनए संरक्षण के लिए मौजूद हैं । जब यूवी LCM के लिए एक प्रयोगात्मक डिजाइन पर विचार, व्यक्तियों के लिए सबसे अच्छा आवश्यकताओं और शुरू करने और समाप्त सामग्री की आवश्यकताओं फिट करने के लिए अपने प्रोटोकॉल दर्जी चाहिए । यहां, हम अलग LCM प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को जोड़ने के लिए पोस्ट-मार्टम मानव सेरिबैलम में Purkinje कोशिकाओं visualizing युक्त रिएजेंट की आवश्यकता के बिना transcriptome के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए तैयार करने के लिए एक बढ़ाया विधि प्रदान करने के लिए Sequencing.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत विशेष रूप से यूवी-LCM के लिए आकृति विज्ञान विशिष्ट ऊतकों visualizing में एक स्टेनलेस दृष्टिकोण हो संशोधित किया है । इस विधि ऊतक दृश्य का एक बढ़ाया स्तर को बनाए रखते हुए, बाद में प्रत्यक्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ंयूयॉर्क ब्रेन बैंक, डॉ जीन पॉल Vonsattel और डॉ Etty Cortés, काटने और इन प्रयोगों के लिए जमे हुए मानव मस्तिष्क ऊतक नमूनों के संरक्षण में उनकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक व्यक्तियों, जो उदारता से आवश्यक कंपन में सतत अनुसंधान के लिए अपने दिमाग दान स्वीकार करना चाहते हैं । dr. Faust और dr. Martuscello कोलंबिया विश्वविद्यालय पैथोलॉजी और सेल जीवविज्ञान के अपने निरंतर समर्थन और कोर अनुसंधान अंतरिक्ष के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक इस प्रोजेक्ट के लिए रिसर्च फंडिंग के लिए NIH R01 NS088257 Louis/Faust) को स्वीकार करना चाहेंगे । LCM छवियों हर्बर्ट Irving व्यापक कैंसर केंद्र में फोकल और विशेष सूक्ष्म साझा संसाधन कोलंबिया विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया, NIH अनुदान #P30 CA013696 (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) द्वारा समर्थित थे । लेखक विशेष माइक्रोस्कोपी के साथ उनके निरंतर सहायता के लिए Theresa Swayne और लौरा Munteanu को स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
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