פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן
Summary
פרוטוקול זה משתמש בגישה העיניינים להמחיש, בידוד תאי Purkinje ברקמת קפוא טרי מן המח האנושי פוסט-מורטם באמצעות לייזר ללכוד microdissection. המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה עבור רצפי RNA.
Abstract
לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי יתרון זה מאפשר עבור האוסף של תאים cytologically או phenotypically רלוונטי או אזורים של רקמות heterogenous. המוצר שנתפסו ניתן להשתמש במגוון של שיטות מולקולריות חלבון, בידוד ה-DNA או RNA. אולם, שימור של RNA מרקמות המוח האנושי לאחר המוות הוא מאתגר במיוחד. טכניקות להדמיה סטנדרטי עבור הפונקציה LCM דורשים היסטולוגית או שגרות מכתימים immunohistochemical אשר יכול לקדם לבזות RNA. לכן, תיכננו פרוטוקול נירוסטה עבור הפריט החזותי LCM עם הייעוד של שמירה על תקינות RNA ברקמת המוח האנושי פוסט-מורטם. התא Purkinje של המוח הקטן הוא מועמד טוב ויזואליזציה אל חלד, עקב בגודל ובמיקום אופיינית. קליפת אסטרוציטומה יש שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, הפיכתם של ארכיטיפ טוב לזיהוי תחת בהגדלה מיקרוסקופית. תאי Purkinje הם נוירונים גדול ממוקם בין השכבה תא גרגר, שהינה רשת סלולרית בצפיפות של נוירונים קטן, השכבה המולקולרית, אשר הוא דליל בגוף התא. בגלל זה אדריכלות, השימוש של ויזואליזציה נירוסטה הוא ריאלי. מערכות אחרות איברים או תא המחקים פנוטיפ זה יהיה גם מתאים. פרוטוקול נירוסטה נועד לתקן רקמת קפוא טרי עם אתנול ולהסיר שומנים עם קסילן להמחשת מורפולוגי משופרת תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה. פרוטוקול זה אינו חשבון בשביל שיטות קיבוע אחרות, היא תוכננה במיוחד עבור דגימות רקמה מוקפאות שנלכדה באמצעות של אולטרה סגול (UV)-מערכת LCM. כאן, אנו מציגים עבור חלוקתה ותיקון רקמות אנושיות אסטרוציטומה טריים קפואים פוסט-מורטם וטיהור של RNA מתאי Purkinje מבודדת על ידי UV-LCM, תוך שמירה על איכות ה-RNA עבור ה-RNA עוקבות-רצף פרוטוקול מלא. בידיים שלנו, פרוטוקול זה מייצר רמות יוצאות דופן של ויזואליזציה הסלולר ללא צורך מכתים ריאגנטים ותשואות RNA במספרים גבוהים RNA תקינות (≥8) לפי הצורך לניסויים פרופיל תעתיק.
Introduction
לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי רב ערך מחקר המאפשרת הפרדת תאים באופן פתולוגי רלוונטי להערכת מולקולרי מונע עוקבות. השימוש של ניתוחים מולקולריים אלו דגימות רקמה הטרוגנית, המתאם עם נתונים פתולוגית וקלינית הוא צעד שנדרש לצורך הערכת המשמעות translational של המחקר הביולוגי1. בעת ניתוח נתוני ביטוי גנים RNA, השימוש של מקטעי רקמת קפוא מומלץ מאוד שכן היא מאפשרת עבור איכות מעולה של RNA וכן מוגדל כמות2. זה הוכח גם כי באיכות גבוהה והן את כמות ה-RNA הם חיוניים עבור נתונים משמעותיים בין רצפי הרנ א3. עם זאת, בעת שימוש RNA מרקמות טריים קפואים פוסט-מורטם עבור הפונקציה LCM, השפלה RNA הוא אתגר גדול, כמו זה מתרחש מיד עם מותו את מימדיו מתווך על ידי גורמים שונים הקשורים עם רקמת אוסף שיטה4,5 . יתר על כן, ה-RNA השפלה היא מתעצמת כאשר טכניקות צביעת נדרשים לזהות פרטים היסטולוגית וזיהוי התא. התמחה מכתים טכניקות, hematoxylin & אאוזין, הכתם Nissl, immunofluorescence ו אימונוהיסטוכימיה מועילים ב המבדילים תאים של משתית שמסביב אבל הוכחו לבזות RNA ולשנות התעתיק ביטוי פרופילים6. לכן, המעבדה שלנו יצרה פרוטוקול נירוסטה שתוכננה במיוחד כדי לשמר RNA המח האנושי פוסט-מורטם למטרות של רצפי RNA לאחר LCM בידוד של נוירונים Purkinje.
עיבוד רקמה קפוא טרי עבור הפונקציה LCM, שיטת קיבוע יכול להשפיע variably RNA וגם רקמות תקינות. קיבוע פורמלין הוא תקן לשימור מורפולוגי, אך גורם cross-linking זה ייתכן קטע RNA ומשבשים RNA הגברה7. קיבוע אתנול הוא חלופה טובה יותר לבידוד RNA, כפי שהוא מקבע coagulative זה לא לגרום cross-linking1. כדי לשפר את החזיית מורפולוגיה רקמות, קסילן היא הבחירה הטובה ביותר, כאשר הוא מסיר שומנים מן הרקמה. עם זאת, שם מוכרים מגבלות כאשר ניצול קסילן ב LCM, כמו הרקמות יכול להתייבש ולהיות שביר-גרימת רקמות פיצול על לייזר לכידת7. קסילן גם רעלן נדיפים, חייבים להיות מטופלים כראוי בשכונה fume. למרות זאת, קסילן הוכח כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה תוך גם שמירה על תקינות רנ א8. לכן, פרוטוקול שלנו סובבת, השימוש של 70% אתנול קיבוע והתייבשות אתנול, ואחריו קסילן הדגירה עבור בהירות מורפולוגי.
חשוב לציין סוגים שונים של מערכות microdissection מבוססת לייזר, כפי הם הוכחו נבדלים מהירות, דיוק ואיכות RNA. הלייזר האינפרא-אדום (IR) ללכוד microdissection ומערכות אולטרה סגול (UV) לייזר microbeam microdissection היו שתי פלטפורמות LCM הרומן שצצו כמעט במקביל8. מערכת אינפרא-אדום-LCM מעסיקה “מערכת קשר” באמצעות סרט גומי סינתטי אשר בהתקשותו שקוף וממוקם על סעיף רקמות, תאים עניין באופן סלקטיבי לדבוק הסרט על-ידי פולסים ממוקד של לייזר אינפרא-אדום. לחלופין, מערכת UV-LCM היא “מערכת ללא מגע” לפיה קרן לייזר ממוקדת חותך את התאים או אזורים של עניין בתוך הרקמה; בהתאם לתצורת ב שתי פלטפורמות מסחריות זמין כעת המשתמשות או עיצוב מיקרוסקופ הפוכה או זקוף, רקמות נרכש מכשיר אוסף ע י גל הלחץ לייזר המושרה זה משפד אותו נגד כוח המשיכה או רקמה אסף על-ידי כוח הכבידה, בהתאמה. יתרונות משמעותיים של מערכת UV-LCM כוללים רכישת תא מהר יותר, ללא זיהום אוסף עם גישה ללא מגע, ניתוח מדויק יותר בשל הרבה יותר קטן לייזר קרן בקוטר9. פרוטוקול זה תוכנן במיוחד עבור מערכת UV-LCM, לא נבדק בכל מערכת אינפרא-אדום-LCM. גם עיצוב מערכת UV-LCM, כאשר תאים צבירת לתוך הכיפה איסוף, שימוש coverslip זה משפר את בהירות הסלולר במהלך מיקרוסקופ אינו מתאים, כמו התאים לא יוכל להיכנס לתוך הכיפה אוסף. לכן, כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה, בדקנו את השימוש של אוסף אטום caps, אשר נועדו לשמש coverslip להמחשת מיקרוסקופיים מערכות UV-LCM, נגד נוזלי אוסף מלא בקבוקים. אוסף מילוי נוזלי כמוסות עשויה להיות מאתגרת, הנוזל כפוף אידוי, יש להחליפם בתדירות גבוהה תוך כדי עבודה על המיקרוסקופ. הזמן הופך להיות גורם חשוב ליציבות RNA, כפי הרקמה שנתפסו לבישום7.
המעבדה שלנו מחקרים השינויים neuropathologic לאחר המוות הקטן בחולים עם רעד חיוני (ET) והפרעות הקשורות ניווניות של הצרבלום. הראו שינויים מורפולוגיות שבמרכזה תאי Purkinje להבחין בין המקרים ET לעומת פקדים, כולל מספר מופחת של תאי Purkinje, גדל רגרסיה דנדריטים וכן מגוון של שינויים עצב, מוביל אותנו בקביעתו Purkinje הזה ניוון תאים היא תכונה וחיסונים הליבה ET פתוגנזה10,11,12,13. פרופיל תעתיק שימש למחלות רבות נוירולוגיים לחקור את הבסיס המולקולרי שבבסיס של שינויים ניווניים הסלולר. עם זאת, פרופילים תעתיק מדגימות הטרוגנית, כגון אזורים רקמת המוח, ניתן לאשש להסוות את הביטוי של הפרוטוקולים שפע נמוכה ו/או לצמצם את הגילוי של השינויים המולקולריים המתרחשים רק אוכלוסיה קטנה של המושפע תאים, כגון תאי Purkinje בקליפת אסטרוציטומה. למשל, תאי Purkinje במידה רבה יותר על ידי תאים גרגר שופע בקליפת אסטרוציטומה מאת; 1:. כ 3000 לפיכך, למקד בצורה יעילה transcriptome שלהם דורשת בידוד ספציפי של נוירונים אלה. קליפת אסטרוציטומה תחום שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, גודל התא. ארכיטקטורה זו הסלולר הוא אידיאלי כדי לדמיין דגימת רקמה קפוא טרי ללא ריאגנטים מכתימים המכילים צבען. בתיאוריה, פרוטוקול זה יכול גם להיות מיושם סוגים אחרים, רקמות כי יש רקמת הייחודי דומה בארגון.
פרוטוקול זה תוכנן לעבוד במיוחד עבור תאי Purkinje הדמיית המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן. פרוטוקולים רבים קיימות עבור הקיבעון, צביעת ויזואליזציה ושימור RNA סוגים רבים של רקמות למטרות של שני IR – ו UV-LCM. כשהוא מהרהר בעל עיצוב ניסיוני עבור UV-LCM, אנשים צריך להתאים נהלים שתתאים בצורה הטובה ביותר את הצרכים ואת הדרישות של להתחלה וסיום חומרים. כאן, אנו משלבים היבטים רבים של פרוטוקולים שונים LCM כדי לספק שיטה משופרת להמחשת תאי Purkinje ושההתפתחות האנושי פוסט-מורטם ללא צורך לצבוע המכיל נוגדנים מכתימים להתכונן RNA באיכות גבוהה transcriptome . רצף.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המובאת כאן במיוחד משתנים להיות בגישה אל חלד ב להמחיש רקמות מורפולוגית נפרדות עבור UV-LCM שיטה זו נועדה להגדיל RNA שלמות עוקבות רצפי RNA ישיר, תוך שמירה על רמת משופרת של רקמות ויזואליזציה. היכולת להבחין בין סוגי תאים שונים עבור לכידה, כדי ליצור את האוכלוסייה הטהור של תאים אפשרי, חיוני לה?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר בנק בניו-יורק המוח, ד ר ז’אן פול Vonsattel, ד ר אטי קורטס, לסיוע שלהם ב חיתוך ושימור דגימות רקמה את המוח האנושי קפוא לניסויים אלה. המחברים רוצה להכיר את האנשים אשר תרם בנדיבות את המוח שלהם למחקר המשך לתוך רעד חיוני. ד ר פאוסט, ד ר Martuscello רוצה להכיר מחלקת פתולוגיה של אוניברסיטת קולומביה, ביולוגיה של התא על תמיכתם המתמשכת הליבה מחקר שטח. המחברים רוצה להכיר NIH R01 NS088257 לואי/פאוסט…) למימון מחקר עבור פרוייקט זה. תמונות LCM בוצעו ב Confocal ולהעניק התמחה מיקרוסקופ לשתף משאבים של הרברט אירווינג מקיף במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת קולומביה, נתמך על ידי NIH #P30 CA013696 (המכון הלאומי לסרטן). המחברים רוצה להכיר תרזה Swayne, לורה מונטאנו לסיוע המשך שלהם עם מיקרוסקופ מיוחד.
Materials
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
Referências
- Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
- Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97 (2006).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. . Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Graeme, M. I. . Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).
- Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
- Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
- Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , 3297-3307 (2007).
- Louis, E. D., et al. Neuropathologic findings in essential tremor. Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Jensen, E. Laser Capture Microdissection. The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).
- Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
- Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).
- Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533 (2016).
- . . Carl Zeiss Microscopy. , (2012).
