بروتوكول غير القابل للصدأ لعزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من الليزر التقاط خلايا ميكروديسيكتيد بوركنجي في المخيخ تشريح الإنسان
Summary
هذا البروتوكول يستخدم نهج خالية من وصمة عار لتصور وعزل خلايا بوركنجي في الأنسجة المجمدة الطازجة من المخيخ البشري بعد الوفاة عن طريق التقاط الليزر ميكروديسيكشن. والغرض من هذا البروتوكول توليد كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتسلسل الحمض النووي الريبي.
Abstract
ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) هو أداة مفيدة أن يسمح للمجموعة من الخلايا ذات الصلة سيتولوجيكالي و/أو فينوتيبيكالي أو مناطق من الأنسجة المتباينين. يمكن استخدام المنتج تم التقاطها في مجموعة متنوعة من الأساليب الجزيئية للبروتينات، عزل الحمض النووي الريبي أو. ومع ذلك، الحفاظ على الحمض النووي الريبي من أنسجة المخ البشري تشريح الجثة تنطوي على تحديات خاصة. تتطلب تقنيات التصور القياسية ل LCM نسيجية أو إجراءات المصبوغة المناعي أن يمكن أن تتحلل الجيش الملكي النيبالي. ولذلك، قمنا بتصميم بروتوكول غير القابل للصدأ للتصور في LCM مع الغرض المقصود من الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في أنسجة المخ البشري بعد الوفاة. خلية بوركنجي في المخيخ مرشح جيد للتصور غير القابل للصدأ، ونظرا لحجم وموقع مميز. قشرة الدماغ لدى الطبقات المتميزة التي تختلف من حيث كثافة الخلايا، مما يجعلهم ركبة جيدة لتحديد تحت مجهر التكبير عالية. هي خلايا بركنج العصبية الكبيرة الواقعة بين طبقة الخلايا الحبيبية، الذي شبكة كثيفة خلوية للخلايا العصبية الصغيرة، وطبقة الجزيئية، ومتفرق في الهيئات الخلية. وبسبب هذا الهيكل، من الممكن استخدام التصور غير القابل للصدأ. أنظمة الجهاز أو الخلايا الأخرى التي تحاكي هذا النمط الظاهري ستكون مناسبة أيضا. تم تصميم البروتوكول غير القابل للصدأ لإصلاح الأنسجة المجمدة الطازجة مع الإيثانول وإزالة الدهون مع زيلين نفط للتصور المورفولوجية تحسين إطار التكبير عالية الخفيفة الميكروسكوب. هذا البروتوكول لا تراعي أساليب التثبيت الأخرى، وهو مصمم خصيصا لعينات الأنسجة المجمدة الطازجة التقاطها باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)-نظام LCM. وهنا، يقدم بروتوكول كامل لتقطيع وإصلاح أنسجة الدماغ البشري الجثة المجمدة الطازجة وتنقية من الجيش الملكي النيبالي من خلايا بوركنجي معزول بواسطة الأشعة فوق البنفسجية-LCM، مع الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي اللاحقة. في أيدينا، هذا البروتوكول وتنتج مستويات استثنائية من التصور الخلوية دون الحاجة لتلطيخ الكواشف وغلة الجيش الملكي النيبالي مع ارتفاع أرقام سلامة الحمض النووي الريبي (إيه إيت) كما أن هناك حاجة لتجارب التنميط النسخي.
Introduction
ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) هو أداة بحثية قيمة تسمح فصل خلايا مرضية ذات الصلة لتقييم جزيئيا مدفوعة اللاحقة. استخدام التحليلات الجزيئية في هذه عينات الأنسجة غير متجانسة والارتباط مع البيانات السريرية والمرضية خطوة ضرورية في تقييم أهمية البحوث البيولوجية1متعدية الجنسيات. عند تحليل البيانات التعبير الجيني من الجيش الملكي النيبالي، استخدام أقسام الأنسجة المجمدة ينصح بشدة كما أنها تسمح للنوعية الممتازة للجيش الملكي النيبالي، فضلا عن أقصى كمية2. ثبت أيضا أن ذات جودة عالية وكمية من الحمض النووي الريبي أساسية للبيانات ذات مغزى من تسلسل الحمض النووي الريبي3. عند استخدام الحمض النووي الريبي من أنسجة الجثة المجمدة الطازجة ل LCM، تدهور الحمض النووي الريبي غير تحديا كبيرا، كما أنه يحدث فورا عند الوفاة ومداه هو توسط مختلف العوامل المرتبطة بالانسجة جمع الأسلوب4،5 . وعلاوة على ذلك، يتفاقم تدهور الجيش الملكي النيبالي عندما المصبوغة التقنيات اللازمة للاعتراف بتفاصيل النسجية وتحديد الخلية. المتخصصة تلطيخ التقنيات، مثل الهيماتوكسيلين ويوزين ونيسل وصمة عار، الفلورة و immunohistochemistry قد تكون مفيدة في تمييز الخلايا من ستروما المحيطة بها لكن ثبت للحط من الجيش الملكي النيبالي، ويغير التعبير نسخة 6من التشكيلات الجانبية. ولذلك، أوجد مختبرنا بروتوكول غير القابل للصدأ مصممة خصيصا للحفاظ على الجيش الملكي النيبالي في المخيخ البشري الجثة لأغراض تسلسل الحمض النووي الريبي بعد عزلة LCM بوركنجي الخلايا العصبية.
في تجهيز الأنسجة المجمدة الطازجة ل LCM، يمكن أن تؤثر طريقة التثبيت مغايرة على سلامة كل من الجيش الملكي النيبالي والأنسجة. التثبيت الفورمالين المعيار للحفاظ على الخصائص المورفولوجية، ولكن الأسباب العابرة للربط التي ربما تفتيت الحمض النووي الريبي وتتداخل مع الحمض النووي الريبي التضخيم7. تثبيت الإيثانول أفضل بديل لعزل الحمض النووي الريبي، كما هو مثبت كواجولاتيفي التي لا تحفز العابرة للربط1. ولتعزيز تصور مورفولوجيا الأنسجة، زيلين نفط هو الخيار الأفضل، كما أنه يزيل الدهون من الأنسجة. ومع ذلك، هناك معروفة القيود عند استخدام زيلين نفط في LCM، الأنسجة يمكن أن تجف وتصبح هشة تفتت الأنسجة تسبب عند التقاط الليزر7. زيلين نفط هو أيضا مادة سامة متقلبة، ويجب أن تعالج بشكل صحيح في غطاء دخان. ومع ذلك، أظهرت زيلين نفط لتعزيز التصور الأنسجة مع أيضا الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي8. لذلك، لدينا بروتوكول تدور حول استخدام التثبيت الإيثانول 70% والجفاف الإيثانول، تليها الحضانة زيلين نفط للوضوح المورفولوجية.
من المهم ملاحظة أنواع مختلفة من نظم الليزر ميكروديسيكتيون، كما أنها أظهرت أن تختلف في السرعة والدقة والجودة الجيش الملكي النيبالي. ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) التقاط ميكروديسيكتيون والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) نظم ميكروديسيكتيون ميكروبيام الليزر كانت كل المنابر LCM الرواية التي ظهرت في نفس الوقت تقريبا8. نظام الأشعة تحت الحمراء-LCM يستخدم “نظام اتصال” استخدام فيلم الحرارة شفافة توضع مباشرة على قسم الأنسجة، والخلايا التي تهم بشكل انتقائي الالتزام بالفيلم بنبضات مركزة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. بدلاً من ذلك، هو نظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM “نظام عدم الاتصال” حيث يقطع شعاع ليزر مركزة بعيداً الخلايا أو المناطق ذات الاهتمام في النسيج؛ اعتماداً على تكوين في اثنين من منصات التجارية المتاحة حاليا التي تستخدم أما على تصميم مجهر المقلوب أو تستقيم، تكتسب الأنسجة في جهاز جمع موجه ضغط المستحثة بالليزر التي المقاليع أنها ضد الجاذبية أو الأنسجة جمع بواسطة الجاذبية، على التوالي. وتشمل مزايا هامة لنظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM اقتناء خلية أسرع، جمع خالية من التلوث مع نهج عدم الاتصال وتشريح أكثر دقة بسبب كثير أصغر ليزر شعاع قطرها9. صمم خصيصا لنظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM هذا البروتوكول ولم يتم اختباره في نظام LCM الأشعة تحت الحمراء. أما تصميم نظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM، عندما تتراكم الخلايا إلى الحد الأقصى جمع، واستخدام ساترة أن يعزز الوضوح الخلوية أثناء الفحص المجهري ليست مناسبة، كما سيكون غير قادر على الدخول في عملية النداءات الموحدة جمع الخلايا. ولذلك، تعزيز التصور الأنسجة، قمنا باختبار استخدام قبعات جمع معتمة، التي تم تصميمها لتعمل بمثابة ساترة للتصور المجهرية في أنظمة الأشعة فوق البنفسجية-LCM، ضد قبعات جمع مليئة السائل. يمكن أن يكون تحديا قبعات جمع مليئة السائل، كما يخضع لتبخر السائل ويجب أن يتم استبداله كثيرا أثناء العمل في المجهر. الوقت يصبح عاملاً مهما للاستقرار في الجيش الملكي النيبالي، كما يذوب الأنسجة تم التقاطها مباشرة7.
لدينا مختبر الدراسات التغييرات نيوروباثولوجيك تشريح الجثة في المخيخ للمرضى الذين يعانون من الهزة الأساسية (ET) واضطرابات الأعصاب المتصلة بها في المخيخ. لقد أظهرنا التغييرات مورفولوجك تتمحور حول خلايا بوركنجي التي تميز بين الحالات ET مقابل عناصر التحكم، بما في ذلك خفض عدد خلايا بوركنجي، ازداد الانحدار الجذعية ومجموعة متنوعة من التغييرات محواري، تؤدي بنا مسلمة أن بوركنجي ضمور الخلية ميزة بيولوجية أساسية في ET المرضية10،11،،من1213. التنميط النسخي قد استخدمت في العديد من أمراض الجهاز العصبي لاستكشاف الأساس الجزيئي الكامنة وراء التغيرات الخلوية التنكسية. بيد النسخي لمحات من عينات غير المتجانسة، مثل مناطق أنسجة المخ، يمكن انتقاص قناع التعبير عن النصوص وفرة منخفضة و/أو تقلل من الكشف عن التغيرات الجزيئية التي تحدث إلا في عدد صغير من سكان من المتضررين الخلايا، مثل خلايا بوركنجي في قشرة الدماغ. على سبيل المثال، خلايا بوركنجي هي فاقت إلى حد كبير من الخلايا الحبيبية وفرة في قشرة الدماغ قبل حوالي زائداً؛ وهكذا، لفعالية الهدف يتطلب بهم الترنسكربيتوم العزلة محددة من هذه الخلايا العصبية. قشرة الدماغ هي رسمتها الطبقات المتميزة التي تختلف من حيث كثافة الخلية وحجم الخلية. هذه البنية الخلوية يعتبر مثاليا لتصور في عينة أنسجة المجمدة الطازجة دون المحتوية على صبغ الكواشف المصبوغة. ومن الناحية النظرية، يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على أنواع الأنسجة الأخرى التي لديها أنسجة مميزة مماثلة المنظمة.
تم تصميم هذا البروتوكول للعمل على وجه التحديد للتصور خلايا بوركنجي في المخيخ البشري بعد الوفاة. وتوجد العديد من البروتوكولات للتثبيت، تلطيخ التصور والحفاظ على الحمض النووي الريبي لأنواع عديدة من الأنسجة للأغراض من كلا الأشعة تحت الحمراء–والأشعة فوق البنفسجية-LCM. عندما تفكر تصميم تجريبي للأشعة فوق البنفسجية-LCM، ينبغي تكييف الأفراد على بروتوكول تناسب احتياجات ومتطلبات من البداية والنهاية المواد. هنا، أن نجمع بين جوانب كثيرة من مختلف البروتوكولات LCM توفير طريقة محسنة لتصور خلايا بوركنجي في المخيخ الجثة البشرية دون الحاجة إلى صبغة تحتوي على كواشف المصبوغة لإعداد الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة الترنسكربيتوم التسلسل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تعديل البروتوكول المعروضة هنا على وجه التحديد أن اتباع نهج غير القابل للصدأ في تصور الأنسجة شكلياً متميزة للأشعة فوق البنفسجية-LCM. يهدف هذا الأسلوب تحقيق أقصى قدر من سلامة الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة اللاحقة، مع الحفاظ على مستوى معزز من التصور الأنسجة. الق?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تود أن تقر بنك “نيويورك الدماغ”، الدكتور جان بول فونساتيل والدكتور إيتي كورتيز، لمساعدتها في قطع والحفاظ على عينات الأنسجة المجمدة الدماغ البشري لهذه التجارب. يود المؤلفون الاعتراف بالأفراد الذين تبرعوا بسخاء على الدماغ للبحوث المستمرة في “الهزة الأساسية”. الدكتور مارتوسسيلو والدكتور فاوست تود أن تقر إدارة جامعة كولومبيا لعلم الأمراض وعلم الأحياء الخلية لدعمهم المستمر والفضاء البحوث الأساسية. المؤلف يود أن يعترف المعاهد الوطنية للصحة R01 NS088257 لويس/فاوست) لتمويل البحوث لهذا المشروع. صور LCM أجريت في كونفوكال ومنح “المتخصصة مجهرية الموارد المشتركة” من مركز السرطان الشامل ايرفينغ هربرت في جامعة كولومبيا، تدعمها المعاهد الوطنية للصحة #P30 CA013696 (المعهد الوطني للسرطان). الكتاب تود أن تقر تيريزا سويني ولورا مونتيانو لمواصلة تقديم المساعدة مع الفحص المجهري المتخصصة.
Materials
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
Referências
- Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
- Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97 (2006).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. . Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Graeme, M. I. . Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).
- Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
- Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
- Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , 3297-3307 (2007).
- Louis, E. D., et al. Neuropathologic findings in essential tremor. Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Jensen, E. Laser Capture Microdissection. The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).
- Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
- Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).
- Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533 (2016).
- . . Carl Zeiss Microscopy. , (2012).
