一种从人类死后小脑中的激光捕获微解剖 purkinje 细胞中分离高质量 rna 的不锈钢协议
Summary
该协议采用无污渍的方法, 通过激光捕获微解剖, 将新鲜冷冻组织中的 purkinje 细胞从人类死后的小脑中观察和分离。该协议的目的是为 rna 测序生成足够数量的高质量 rna。
Abstract
激光捕获显微解剖 (lcm) 是一个有利的工具, 允许收集细胞学和/或表型相关的细胞或区域从异质组织。捕获的产品可用于蛋白质、dna 或 rna 分离的多种分子方法。然而, 从死后的人类脑组织中保存 rna 尤其具有挑战性。lcm 的标准可视化技术需要组织或免疫组化染色程序, 可以进一步降解 rna。因此, 我们设计了一种用于 lcm 可视化的不锈钢协议, 其目的是在死后的人类脑组织中保持 rna 完整性。小脑的 purkinje 细胞是一个很好的选择, 不锈钢可视化, 由于其大小和特点的位置。小脑皮层具有不同的细胞密度层, 使其成为高放大显微镜下识别的良好原型。purkinje 细胞是位于颗粒细胞层 (即一个由小神经元组成的密被体细胞网络) 和分子层 (在细胞体中稀疏) 之间的大神经元。由于这种架构, 使用不锈钢可视化是可行的。其他模仿这种表型的器官或细胞系统也是合适的。该不锈钢协议旨在用乙醇固定新鲜冷冻组织, 并用二甲苯去除脂类, 以便在高放大光显微镜下进行形态可视化。该协议不包括其他固定方法, 是专门为使用紫外线 (uv)-lcm 系统采集的新鲜冷冻组织样本而设计的。在这里, 我们提出了一个完整的协议, 用于切片和固定新鲜冷冻的人类小脑组织和纯化 rna 从 purkinje 细胞分离的 uv-lcm, 同时保持 rna 质量, 以便随后的 rna 测序。在我们手中, 该协议产生了卓越的细胞可视化水平, 而不需要染色试剂, 并产生 rna 与高 rna 完整性数字 (≥8) 的转录分析实验所需的。
Introduction
激光捕获显微解剖 (lcm) 是一种有价值的研究工具, 可用于分离与病理相关的细胞, 以便随后进行分子驱动的评估。在这些异质组织标本中使用分子分析以及与病理和临床数据的相关性是评价生物研究转化意义的必要步骤1。在分析来自 rna 的基因表达数据时, 强烈建议使用冷冻组织切片, 因为它允许出色的 rna 质量以及最大限度地提高2数量.众所周知, 高质量和数量的 rna 对于来自 rna 测序3的有意义的数据至关重要。然而, 当使用来自新鲜冷冻尸检组织的 rna 进行 lcm 时, rna 降解是一个重大挑战, 因为它在死亡后立即发生, 其范围是由与组织收集方法4,5 相关的各种因素介导的..此外, 当需要染色技术来识别组织学细节和细胞鉴定时, rna 降解会加剧。专门的染色技术, 如血红素 & eosin、nysl 染色、免疫荧光和免疫组织化学, 有助于区分细胞与周围的间质, 但已被证明可以降解 rna 并改变转录表达配置文件6。因此, 我们的实验室已经创建了一个不锈钢协议, 专门用于保存死后人类小脑中的 rna, 以便在 purkinje 神经元 lcm 分离后进行 rna 测序。
在处理新鲜冷冻组织的 lcm, 固定方法可以不同程度地影响 rna 和组织的完整性。福尔马林固定是形态保存的标准, 但引起交联, 可能会分裂 rna 并干扰 rna 扩增7。乙醇固定是 rna 分离的更好的替代品, 因为它是一种凝固性的固定剂, 不会诱导交联1。为了增强组织形态的可视化效果, 二甲苯是最佳选择, 因为它能去除组织中的脂质。然而, 在 lcm 中使用二甲苯时, 有已知的局限性, 因为在激光捕获7时, 二甲苯会干涸并变得脆弱, 导致组织碎裂。二甲苯也是一种挥发性毒素, 必须在烟罩中妥善处理。然而, 二甲苯已被证明可以增强组织的可视化, 同时也保持 rna 的完整性8。因此, 我们的协议围绕70% 的乙醇固定和乙醇脱水的使用, 其次是二甲苯孵化的形态清晰度。
需要注意的是, 不同类型的基于激光的微解剖系统, 因为它们在速度、精度和 rna 质量方面已经被证明是不同的。红外 (ir) 激光捕获显微解剖和紫外 (uv) 激光微束显微解剖系统都是新颖的 lcm 平台, 几乎同时出现 8。ir-lcm 系统采用 “接触系统”, 使用直接放置在组织部分的透明热塑性薄膜, 感兴趣的细胞通过红外激光的聚焦脉冲选择性地粘附在薄膜上。或者, uv-lcm 系统是一个 “非接触系统”, 其中聚焦激光束切断细胞或区域的利益在组织;根据两个现有商业平台的配置, 使用倒置或垂直显微镜设计, 组织被激光诱导的压力波获取到采集设备中, 该压力波将其弹射到重力或组织上。分别由重力收集。uv-lcm 系统的显著优势包括更快的细胞采集、无接触式方法的无污染收集以及由于激光束直径更小的9而进行更精确的解剖。该协议是专为 uv-lcm 系统设计的, 尚未在 ir-lcm 系统中进行测试。在 uv-lcm 系统设计中, 当细胞积累到收集盖时, 在显微镜下使用增强细胞清晰度的盖板是不合适的, 因为细胞将无法进入收集盖。因此, 为了增强组织可视化, 我们测试了不透明收集帽的使用, 该盖的设计目的是作为 uv-lcm 系统中微观可视化的盖板, 以防止液体填充收集盖。液体填充收集盖可能具有挑战性, 因为液体会蒸发, 并且在显微镜下工作时必须频繁更换。时间成为 rna 稳定性的一个重要因素, 因为捕获的组织会立即溶解7。
我们的实验室研究小脑死后的神经病理学变化, 即原发性震颤 (et) 和相关的小脑神经退行性疾病。我们已经证明了以 purkinje 细胞为中心的形态变化, 区分 et 病例和对照, 包括减少 purkinje 细胞的数量, 增加树突回归和各种轴突变化, 导致我们假设 purkinje细胞变性是 et 发病机制 10、11、12、13的核心生物学特征。转录性分析已被用于许多神经疾病, 以探索潜在的分子基础退行性细胞变化。然而, 来自异质性样本 (如脑组织区域) 的转录谱可以有效地掩盖低丰度转录的表达, 或减少仅在少数受影响人群中发生的分子变化的检测细胞, 如小脑皮层中的 purkinje 细胞。例如, 由于小脑皮层丰富的颗粒细胞, purkinje 细胞的数量远远超过约 1:3000;因此, 要有效地靶向他们的转录组需要这些神经元的特定隔离。小脑皮层由不同的层, 不同的细胞密度和细胞大小来描绘。这种细胞结构是理想的可视化在新鲜冷冻组织样本没有含染料染色试剂。从理论上讲, 该协议也可应用于其他组织类型具有类似的独特组织组织。
该协议旨在专门用于人类死后小脑中的 purkinje 细胞可视化。许多协议存在于许多类型的组织的固定、染色可视化和 rna 保存方面, 用于 ir-lcm 和 uv-lcm。在考虑 uv-lcm 的实验设计时, 个人应根据启动和结束材料的需要和要求调整其协议。在这里, 我们结合不同的 lcm 协议的许多方面, 提供了一种增强的方法, 可视化 purkinje 细胞在死后的人小脑, 而不需要染料含有染色试剂准备高质量的 rna 转录组测 序。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的协议经过专门修改, 成为一种不锈钢方法, 用于直观-lcm 的形态上不同的组织的可视化。此方法旨在最大限度地提高 rna 完整性, 以便随后进行直接 rna 测序, 同时保持组织可视化水平的提高。能够区分不同的细胞类型进行捕获, 创造尽可能纯净的细胞群, 对于了解人体组织中的不同分子特征是必不可少的.在本协议的范围内, 组织选择是最重要的, 因为抗原或染料特异性试?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢纽约脑库、jean paul vonsattel 博士和 etty cortés 博士在切割和保存冷冻人类脑组织样本方面的帮助。作者要感谢那些慷慨地捐献大脑用于对基本震颤的持续研究的个人。福斯特博士和马尔特切洛博士要感谢哥伦比亚大学病理学和细胞生物学系的持续支持和核心研究空间。作者希望感谢 nih r01 ns088257 louissw) 为这个项目的研究资金。在国家卫生研究院赠款 #P30 ca013696 (国家癌症研究所) 的支持下, 在哥伦比亚大学 herbert irving 综合癌症中心的共聚焦和专门显微镜共享资源中进行了 lcm 图像。作者们要感谢特蕾莎·斯韦恩和劳拉·蒙泰亚努在专业显微镜方面的持续帮助。
Materials
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
Referências
- Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
- Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97 (2006).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. . Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Graeme, M. I. . Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).
- Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
- Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
- Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , 3297-3307 (2007).
- Louis, E. D., et al. Neuropathologic findings in essential tremor. Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Jensen, E. Laser Capture Microdissection. The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).
- Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
- Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).
- Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533 (2016).
- . . Carl Zeiss Microscopy. , (2012).
