En rustfri protokol for høj kvalitet RNA isolering fra Laser fange Microdissected Purkinje celler i den menneskelige Post Mortem lillehjernen

Summary

Denne protokol bruger en plet-fri tilgang til at visualisere og isolere Purkinje celler i frisk frosset væv fra menneskelige post mortem lillehjernen via laser fange microdissection. Formålet med denne protokol er at generere tilstrækkelige mængder af høj kvalitet RNA til RNA-sekvens.

Abstract

Laser fange microdissection (LCM) er en fordelagtig værktøj, der giver mulighed for indsamling af cytologically og/eller fænotype relevante celler eller områder fra heterogene væv. Tilfangetagne produkt kan anvendes i en bred vifte af molekylære metoder til protein, DNA eller RNA isolering. Bevarelse af RNA fra postmortem menneskelige hjernevæv er imidlertid især udfordrende. Standard visualiseringsteknikker til LCM kræver histologisk eller immunhistokemisk farvning procedurer, der kan yderligere nedbrydes RNA. Derfor, vi har udviklet et rustfrit protokol for visualisering i LCM med formål at opretholde RNA integritet i post mortem menneskelige hjernevæv. Cellen Purkinje i lillehjernen er en god kandidat til rustfrit visualisering, på grund af sin størrelse og karakteristiske placering. Den cerebellare cortex har adskilte lag, der adskiller sig i celle tæthed, hvilket gør dem en god arketype at identificere under høj forstørrelse mikroskopi. Purkinje celler er store neuroner beliggende mellem granulet cellelag, der er et tæt netværk af små neuroner, og den molekylære lag, som er sparsom i celle organer. På grund af denne arkitektur er brugen af rustfrit visualisering muligt. Andre orgel eller celle-systemer, der efterligner denne fænotype ville også være passende. Rustfrit protokollen er designet til at lave frisk frosset væv med ethanol og fjerne lipider med xylen til forbedret morfologiske visualisering under høj forstørrelse lysmikroskopi. Denne protokol tager ikke højde for andre metoder, fiksering og er specielt designet til frisk frosset vævsprøver taget til fange ved hjælp af en ultraviolet (UV)-LCM-systemet. Vi præsenterer her, en fuld protokol til skæring og fastsættelse af frisk frosset post mortem menneskelige cerebellare væv og oprensning af RNA fra Purkinje celler isoleret af UV-LCM, samtidig bevare RNA kvalitet for efterfølgende RNA-sekvens. I vores hænder denne protokol producerer ekstraordinære niveauer af cellulære visualisering uden behov for farvning reagenser og udbytter RNA med høj RNA integritet numre (≥8), som er nødvendig for transcriptional profilering eksperimenter.

Introduction

Laser fange microdissection (LCM) er en værdifuld forskningsværktøj, der giver mulighed for adskillelse af patologisk relevante celler for efterfølgende molekylemæssigt drevet evaluering. Brugen af molekylære analyser i disse heterogen væv prøver og korrelation med patologiske og kliniske data er et nødvendigt trin i evalueringen translationel betydningen af biologiske forskning¹. Når du analyserer genekspression data fra RNA, brug af frossen væv sektioner er stærkt anbefales, da det giver mulighed for fremragende kvalitet af RNA samt maksimeret mængde². Det har været godt etableret, at høj kvalitet og kvantitet af RNA er afgørende for meningsfulde data fra RNA sekventering³. Ved brug af RNA fra frisk frosset post mortem væv for LCM, er RNA nedbrydning imidlertid en stor udfordring, da det opstår umiddelbart efter døden og dens omfang er medieret af forskellige faktorer i forbindelse med væv samling metode^4,5 . Derudover er RNA nedbrydning forværret, når farvning teknikker er nødvendige for at genkende histologiske detaljer og celle identifikation. Specialiseret farvning teknikker, såsom hæmatoxylin og eosin, Nissl pletten, immunofluorescens og Immunhistokemi er nyttige i at differentiere celler fra omkringliggende stroma men har vist sig at nedbrydes RNA og ændre udskrift udtryk Profiler⁶. Vores laboratorium har derfor lavet en rustfri protokollen specielt designet til at bevare RNA i post mortem menneskelige lillehjernen med henblik på RNA sekventering efter LCM isolation af Purkinje neuroner.

I forarbejdning frisk frosset væv til LCM’EN, kan metoden fiksering trinløst påvirke både RNA og væv integritet. Formalin fiksering er standard for morfologiske bevarelse, men årsagerne cross-linking der kan splitte RNA og forstyrre RNA forstærkning⁷. Ethanol fiksering er et bedre alternativ til RNA isolering, da det er en coagulative fiksativ, der ikke inducerer tværbindingsmidler¹. For at forbedre visualiseringen af væv morfologi, er xylen det bedste valg, da det fjerner lipider fra vævet. Dog er der kendte begrænsninger når udnytte xylen i LCM, som væv kan tørre ud og blive skør forårsager væv fragmentering ved laser capture⁷. Xylen er også en svingende toksin og skal håndteres korrekt i et stinkskab. Ikke desto mindre har xylen vist sig at øge væv visualisering samtidig også bevare RNA integritet⁸. Derfor Centre vores protokol rundt om brugen af 70% ethanol fiksering og ethanol dehydrering, efterfulgt af xylen inkubation i morfologiske klarhed.

Det er vigtigt at bemærke de forskellige typer af laser-baseret microdissection systemer, som de har vist sig at variere i hastighed, præcision og RNA kvalitet. Den infrarøde (IR) laser fange microdissection og ultraviolet (UV) laser microbeam microdissection systemer var begge roman LCM-platforme, der opstod næsten samtidigt⁸. IR-LCM-systemet anvender en “kontakt-system”, ved hjælp af en gennemsigtig termoplastisk film placeret direkte på afsnittet væv og celler af interesse overholde selektivt til filmen af fokuseret impulser fra en IR laser. Alternativt, UV-LCM-systemet er en “ikke-kontakt system” hvorved et fokuserede laserstråle skærer væk celler eller områder af interesse i væv; afhængigt af konfigurationen i to i øjeblikket tilgængelige kommercielle platforme, der bruger enten en inverteret eller opretstående mikroskop design, væv er erhvervet i en samling enhed af en laser-induceret trykbølge, der katapulter det mod tyngdekraften eller væv er indsamlet af tyngdekraften, henholdsvis. Betydelige fordele af UV-LCM-systemet omfatter hurtigere celle erhvervelse, forurening-fri samling med ikke-kontakt tilgang og mere præcise dissektion på grund af en meget mindre laser stråle diameter⁹. Denne protokol blev udviklet specielt til en UV-LCM-systemet og er ikke blevet testet i en IR-LCM-systemet. I enten UV-LCM systemdesign, når akkumulere celler ind i samlingen hætten, brug af en coverslip, øger er cellulære klarhed under mikroskopi ikke egnet, da cellerne ville være i stand til at indgå i samling fælles landbrugspolitik. Derfor, for at forbedre væv visualisering, vi har testet brugen af uigennemsigtige samling caps, der er designet til at fungere som en coverslip for mikroskopiske visualisering i UV-LCM systemer, mod flydende fyldt samling caps. Flydende fyldt samling caps kan være udfordrende, da væsken er underlagt fordampning og skal udskiftes ofte mens du arbejder på mikroskopet. Tid bliver en vigtig faktor for RNA stabilitet, som de erobrede væv opløser straks⁷.

Vores laboratorium undersøgelser postmortem neuropathologic ændringerne i lillehjernen af patienter med væsentlige tremor (ET) og relaterede neurodegenerative lidelser i lillehjernen. Vi har demonstreret morfologiske ændringer centreret om Purkinje celler, der adskiller ET tilfælde versus kontrol, herunder et reduceret antal Purkinje celler, øget dendritiske regression og en række cytoskeletale ændringer, der fører os til at postulere at Purkinje celle degeneration er en core biologiske funktion i ET patogenese^10,11,12,13. Transkriptionel profilering er blevet brugt i mange neurologiske sygdomme til at udforske den underliggende molekylære grundlag af degenerative cellulære ændringer. Men, transcriptional profiler fra heterogene prøver, som hjernen væv regioner, kan virkning maske udtryk for lav overflod udskrifter og/eller mindske påvisning af molekylære forandringer, der sker kun i en lille population af berørte celler, såsom Purkinje celler i den cerebellare cortex. For eksempel, er Purkinje celler langt undertal af rigelige granula celler i den cerebellare cortex af ca 1:3000; således, at effektivt målrette deres transkriptom kræver specifikke isolation af disse neuroner. Den cerebellare cortex er afgrænset af forskellige lag, der adskiller sig i celle tæthed og Cellestørrelse. Denne cellulære arkitektur er ideel til at visualisere i en frisk frosset vævsprøve uden dye-holdige farvning reagenser. I teorien, kunne denne protokol også anvendes til andre vævstyper, der har samme karakteristiske væv organisation.

Denne protokol blev designet til at arbejde specifikt for Purkinje celle visualisering i menneskelige post mortem lillehjernen. Mange protokoller findes for fiksering, farvning visualisering og RNA bevarelsen af mange typer af væv med henblik af både IR – og UV-LCM. Når overvejer en eksperimenterende design for UV-LCM, skal enkeltpersoner skræddersy deres protokol bedst passer til de behov og krav af start- og slutdatoer materialer. Her, kombinerer vi mange aspekter af forskellige LCM protokoller til at give en forbedret metode til at visualisere Purkinje celler i post mortem menneskelige lillehjernen uden farvestof indeholdende farvning reagenser skal forberede transkriptom høj kvalitet RNA sekventering.

Protocol

Alle menneskelige prøver udnyttes i denne protokol er blevet tilvejebragt med informeret samtykke og er blevet godkendt af interne Review Board (IRB) ved Columbia University og Yale University. Bemærk: Helhed af denne protokol skal følge strenge RNA håndtering retningslinjer, hvorved en behandskede hånd bruges altid, alle overflader rengøres med en RNase decontaminator og alle arbejdende materialer er RNA/DNA/nukleasen gratis. 1. test RNA integr…

Representative Results

Denne protokol detaljer trin for at forberede UV-LCM frisk frosset post mortem menneskelige hjernevæv. Grundig specifikationer og anmærkninger er givet for kryostaterne skæring, da det kan være svært at skære frisk frosset hjernevæv med en høj grad af præcision. Det vigtigste punkt at overveje er, at frisk frosset væv er ekstremt kolde og kræver en betydelig mængde af tid til at acclimate til et kryostaten varmere temperatur. Dette trin kan ikke være forhastet, og det kan ikk…

Discussion

Protokollen præsenteres her er specielt modificeret til at blive en rustfri tilgang i at visualisere morfologisk forskellige væv for UV-LCM. Denne metode er designet til at maksimere RNA integritet for efterfølgende direkte RNA sekventering, samtidig med at en øget niveau af væv visualisering. Evnen til at skelne mellem forskellige celletyper til fange, hvis du vil oprette den reneste befolkning af celler muligt, er afgørende for at forstå forskellige molekylære profiler i humane væv¹⁵. I…

Materials

MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.