Een RVS Protocol voor hoge kwaliteit RNA isolatie van Laser vangen Microdissected Purkinje cellen in het menselijke Post Mortem Cerebellum

Summary

Dit protocol maakt gebruik van een vlek-vrije benadering om te visualiseren en te isoleren Purkinje cellen in vers bevroren weefsel van menselijke post mortem cerebellum via laser vangt microdissection. Het doel van dit protocol is het genereren van voldoende hoeveelheden van hoogwaardige RNA voor RNA-sequencing.

Abstract

Laser vangt microdissection (LCM) is een voordelig hulpmiddel waarmee voor de collectie van cytologically en/of fenotypische relevante cellen of gebieden uit heterogene weefsels. Opgenomen product kan worden gebruikt in een verscheidenheid van moleculaire methoden voor eiwitten, DNA of RNA isolatie. Behoud van RNA van menselijke postmortem hersenweefsel is echter vooral een uitdaging. Standaard visualisatietechnieken voor LCM vereisen histologische of immunohistochemische kleuring procedures die verder kunnen degraderen RNA. Dus, we ontwierpen een RVS protocol voor visualisatie in LCM met het beoogde doel van het behoud van de integriteit van het RNA in post mortem menselijk hersenweefsel. Het Purkinje-cel van het cerebellum is een goede kandidaat voor RVS visualisatie, vanwege zijn omvang en karakteristieke locatie. De cerebellaire cortex heeft duidelijke lagen die in celdichtheid verschillen, waardoor ze een goede archetype te identificeren onder hoge vergroting microscopie. Purkinje cellen zijn grote neuronen, gelegen tussen de submodule cellaag, oftewel een dichtbevolkte cellulair netwerk van kleine neuronen, en de moleculaire laag, die is schaars in cel organen. Vanwege deze architectuur is het gebruik van roestvast staal visualisatie haalbaar. Andere orgaan of cel systemen die dit fenotype na te bootsen zou ook geschikt. Het RVS protocol is ontworpen voor vers bevroren weefsel herstellen met ethanol en verwijderen van lipiden met xyleen voor verbeterde morfologische visualisatie onder de lichte microscopie van hoge vergroting. Dit protocol houdt geen rekening met andere methoden fixatie en is speciaal ontworpen voor vers bevroren weefselsteekproeven gevangen met behulp van een ultraviolet (UV)-LCM systeem. Hier presenteren we een volledige protocol voor segmenteren en tot vaststelling van vers bevroren post mortem menselijk cerebellaire weefsel en zuivering van RNA van Purkinje cellen geïsoleerd door UV-LCM, met behoud van RNA kwaliteit voor latere RNA-sequencing. In onze handen, dit protocol uitzonderlijke niveau van cellulaire visualisatie zonder de noodzaak voor kleurstoffen produceert en levert RNA met hoge RNA integriteit nummers (≥8) zo nodig voor transcriptionele profiling experimenten.

Introduction

Laser vangt microdissection (LCM) is een waardevolle onderzoeksinstrument waarmee de scheiding van pathologisch relevante cellen voor moleculair gedreven evaluatie achteraf. Het gebruik van moleculaire analyses in deze specimens van heterogene weefsel en de correlatie met pathologische en klinische gegevens is een noodzakelijke stap bij de beoordeling van de translationeel betekenis van biologisch onderzoek¹. Bij het analyseren van gen expressie gegevens uit RNA, het gebruik van bevroren weefselsecties wordt sterk aanbevolen omdat het zorgt voor uitstekende kwaliteit van RNA evenals hoeveelheid²gemaximaliseerd. Het is goed opgezet dat hoge kwaliteit en kwantiteit van RNA essentieel voor zinvolle gegevens van RNA sequencing^{3 zijn}. Wanneer met RNA uit vers bevroren post mortem weefsel voor LCM, is aantasting van het RNA echter een grote uitdaging, aangezien het vindt onmiddellijk plaats bij overlijden en de omvang ervan is bemiddeld door verschillende factoren die samenhangen met het weefsel collectie methode^4,5 . Bovendien is de aantasting van het RNA verergerd wanneer kleuring technieken nodig zijn om te herkennen van de histologische details en identificatie van de cel. Gespecialiseerd kleuring technieken, zoals de haematoxyline en eosine, Nissl vlek, immunofluorescentie en immunohistochemistry zijn behulpzaam bij het differentiëren van cellen van omliggende stroma maar hebben aangetoond dat degraderen van RNA en transcript expressie wijzigen profielen⁶. Ons laboratorium heeft daarom een RVS protocol specifiek ontworpen om te bewaren van RNA in post mortem menselijk cerebellum voor de toepassing van RNA sequencing na LCM Purkinje neuronen Isolatievan gemaakt.

Bij de verwerking van vers bevroren weefsel voor LCM, kan de methode fixatie variabel beïnvloeden zowel RNA en weefsel integriteit. Formaline fixatie is standaard voor morfologische behoud, maar oorzaken die dwarsbinding kunnen fragment van RNA en interfereren met RNA amplificatie⁷. Ethanol fixatie is een beter alternatief voor RNA isolatie, want het is een coagulative fixatief die niet toe cross-linking^{1 brengt er}. Ter verhoging van de visualisatie van weefsel morfologie, is xyleen de beste keuze, zoals het lipiden uit het weefsel verwijdert. Echter, er zijn bekende beperkingen wanneer met behulp van xyleen in LCM, zoals de weefsels kunnen uitdrogen en broos waardoor weefsel fragmentatie op laser vastleggen⁷geworden. Xyleen is ook een vluchtige toxine en correct moet worden behandeld in een zuurkast. Xyleen heeft echter aangetoond dat weefsel visualisatie ook behoud van RNA integriteit⁸verbeteren. Daarom is ons protocol gecentreerd rond het gebruik van 70% ethanol fixatie en ethanol uitdroging, gevolgd door xyleen broedtijd morfologische duidelijkheid.

Het is belangrijk op te merken van de verschillende soorten microdissection laser gebaseerde systemen, zoals ze verschillen in snelheid, precisie en kwaliteit van RNA is gebleken. De infrarood (IR) laser vastleggen van microdissection en het ultraviolette (UV) microbeam microdissection lasersystemen waren beide roman LCM-platforms die ontstaan bijna gelijktijdig⁸. De IR-LCM-systeem maakt gebruik van een “contact systeem” met behulp van een transparante kunststof film rechtstreeks op de weefselsectie geplaatst, en cellen van belang zich selectief aan de film door gerichte pulsen van een IR-laser. U kunt ook is de UV-LCM-systeem een “contactloze systeem” waarbij een gerichte laserstraal weg de cellen of de regio’s van belang in het weefsel snijdt; afhankelijk van de configuratie in twee momenteel beschikbare commerciële platforms die gebruik maken van ofwel een omgekeerde of rechtop Microscoop ontwerp, weefsel is verworven in een collectie apparaat door een laser-geïnduceerde druk golf die het tegen de zwaartekracht katapulten of weefsel is verzameld door de zwaartekracht, respectievelijk. Belangrijke voordelen van het UV-LCM-systeem zijn snellere cel acquisitie, verontreiniging-gratis-collectie met de contactloze aanpak en nauwkeuriger dissectie als gevolg van een veel kleinere laser beam diameter⁹. Dit protocol werd speciaal ontworpen voor een UV-LCM-systeem en is niet getest in een IR-LCM-systeem. In het ontwerp van het systeem van beide UV-LCM, wanneer accumuleren cellen in het GLB van de verzameling, het gebruik van een dekglaasje aan die verbetert de is cellulaire duidelijkheid tijdens microscopie niet geschikt, zoals de cellen zou kunnen aangaan van het GLB van de collectie. Daarom, om weefsel visualisatie te verbeteren, we testten het gebruik voor dekkende verzameling caps, die zijn ontworpen om te fungeren als een dekglaasje aan voor microscopische visualisatie in UV-LCM systemen, tegen vloeistof gevulde collectie caps. Vloeistof gevulde collectie caps kunnen lastig zijn, als de vloeistof onderworpen aan verdamping is en moet regelmatig worden vervangen terwijl het werken bij en met de Microscoop. Tijd wordt een belangrijke factor voor de stabiliteit van het RNA, zoals het vastgelegde weefsel onmiddellijk^{7 lost}.

Ons laboratorium studies de postmortem neuropathologic veranderingen in het cerebellum van patiënten met essentiële tremor (ET) en verwante neurodegeneratieve aandoeningen van het cerebellum. We hebben bewezen morfologische veranderingen gecentreerd op Purkinje-cellen die het onderscheiden van ET gevallen ten opzichte van de besturingselementen, met inbegrip van een verminderd aantal Purkinje cellen, verhoogd dendritische regressie en een verscheidenheid van axonale veranderingen, leidt ons om te postuleren dat Purkinje cel degeneratie is een biologische functie van de kern in ET pathogenese^10,11,12,13. Transcriptionele profilering is gebruikt in vele neurologische ziekten te verkennen van de onderliggende moleculaire basis van degeneratieve cellulaire veranderingen. Echter transcriptionele profielen uit heterogene monsters, zoals weefsel hersengebieden, kunnen effectually maskeren de uitdrukking van lage overvloed transcripten en/of verminderen de detectie van moleculaire veranderingen die alleen in een kleine populatie van waarin dit probleem optreedt optreden cellen, zoals Purkinje cellen in de cerebellaire cortex. Bijvoorbeeld, Purkinje cellen zijn enorm in de minderheid door de overvloedige submodule cellen in de cerebellaire cortex door ongeveer 1:3000; dus effectief richten vereist hun transcriptome specifieke isolatie van deze neuronen. De cerebellaire cortex is afgebakend door verschillende lagen die in de celdichtheid en celgrootte verschillen. Deze cellulaire architectuur is ideaal om te visualiseren in een monster van de vers bevroren weefsel zonder kleurstof bevattende kleuring reagentia. In theorie kan dit protocol ook worden toegepast op andere weefseltypes (HLA) die soortgelijke onderscheidend weefsel hebben organisatie.

Dit protocol werd ontworpen om werk speciaal voor Purkinje cel visualisatie in het cerebellum van menselijke post-mortem. Er zijn talrijke protocollen voor de fixatie, visualisatie en RNA behoud van vele soorten weefsels ten behoeve van zowel IR – en UV-LCM kleuring. Wanneer overweegt een proefopzet voor UV-LCM, moeten individuen hun protocol om het beste passen bij de behoeften en eisen van de begin- en einddatum van de materialen op maat. Hier combineren we vele aspecten van verschillende LCM protocollen om te zorgen voor een verbeterde methode voor het visualiseren van Purkinje cellen in het post mortem menselijk cerebellum zonder de noodzaak van kleurstof bevattende kleuring reagentia voor te bereiden op kwalitatief hoogwaardige RNA transcriptome sequencing.

Protocol

Alle menselijke specimens die in dit protocol wordt gebruikt met geïnformeerde toestemming hebben verkregen en zijn goedgekeurd door de interne Review Board (IRB) aan Columbia University en aan Yale University. Opmerking: Het geheel van dit protocol moet volgen strikte RNA behandeling richtlijnen, waarbij een gehandschoende hand altijd wordt gebruikt, alle oppervlakken worden gereinigd met een RNase waterbasis en alle werken materialen RNA/DNA/Nuclease gratis zijn. <p cla…

Representative Results

Dit protocol detailleert de stappen voor het voorbereiden van vers bevroren post mortem menselijk hersenweefsel voor UV-LCM. Grondig specificaties en aantekeningen worden gegeven voor het snijden van de cryostaat, als het kan moeilijk zijn om te snijden vers bevroren hersenweefsel met een hoge mate van precisie. Het belangrijkste punt om te overwegen is dat vers bevroren weefsel extreem koude is en vereist een aanzienlijke hoeveelheid tijd om te acclimatiseren aan de warmere temperatuur v…

Discussion

Het protocol hier gepresenteerd is speciaal aangepast om een RVS aanpak in het visualiseren van morfologisch verschillende weefsels voor UV-LCM. Deze methode is ontworpen om te maximaliseren RNA integriteit voor latere directe RNA sequencing, met behoud van een hoger beveiligingsniveau van weefsel visualisatie. Het vermogen om te onderscheiden van de verschillende soorten cellen voor het vastleggen, maken de zuiverste bevolking van cellen mogelijk, is van essentieel belang voor het begrijpen van de verschillende Molecula…

Materials

MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.