ステンレス高品質レーザーからの RNA の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 Microdissected プルキンエ細胞
Summary
このプロトコルは、視覚化し、キャプチャ レーザーマイクロダイ死後人間小脳から新鮮凍結組織におけるプルキンエ細胞を分離する染色無料のアプローチを使用します。このプロトコルの目的は、RNA 配列のため質の高い RNA の十分な量を生成することです。
Abstract
レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、細胞診および/または表現型に関連する細胞または異種組織からの領域のコレクションでは、有利なツールです。さまざまな蛋白質のための分子方法でキャプチャされた製品を使用できます DNA または RNA の分離。しかし、死後の人間の脳組織からの RNA の保全は特に挑戦的です。LCM の標準的な可視化技術、組織学的またはさらに免疫組織化学的染色手順 RNA を低下します。したがって、LCM の死後ひと脳組織の RNA の整合性を維持する目的で可視化のためステンレスのプロトコルを設計しました。小脳のプルキンエ細胞は、ステンレスの可視化, その大きさと特徴的な場所のための良い候補です。小脳皮質には、細胞密度、高倍率顕微鏡を識別する良い原型を作るそれらの異なる個別の層があります。プルキンエ細胞は大型ニューロンの小型ニューロンの特性の密度の高い携帯電話ネットワークは、顆粒細胞の層と細胞体の中に疎である分子の層の間に位置しています。このアーキテクチャのためステンレスの可視化の使用は可能です。この表現型を模倣する他の臓器や細胞システムは、適当でしょう。ステンレスのプロトコルはエタノールで新鮮凍結組織を固定し、高倍率光学顕微鏡形態学的可視化改善のためキシレンと脂質を除去する設計されています。このプロトコルは、他の固定方法については考慮しませんし、uv (紫外線) を使用してキャプチャした新鮮凍結組織サンプルは専用-LCM システム。ここでは、断面および後続の RNA 配列の RNA の品質を維持しながら UV LCM のプルキンエ細胞から新鮮な冷凍死後ひと小脳組織との RNA の浄化を修正する完全なプロトコルを提案する.私たちの手でこのプロトコルは染色試薬を必要とせず細胞可視化の例外的なレベルを生成し、転写プロファイリング実験に必要な高い RNA 整合性数字 (≥8) で RNA が得られます。
Introduction
レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、その後分子駆動評価の病理組織学的に関連する細胞の分離を可能にする貴重な研究ツールです。これら異種組織標本の病理組織学的および臨床的データとの相関分子生物学的解析の使用は、生物学的研究1の並進運動の意義を評価する際に必要なステップです。RNA による遺伝子発現データを解析するとき凍結するティッシュ セクションの使用それは RNA の優れた品質のことができますようお勧めと同様数量2を最大化します。それが RNA シーケンス3から意味のあるデータに不可欠な高品質・ RNA 量も確立されています。ただし、最小公倍数の新鮮な冷凍事後組織からの RNA を使用している場合 RNA の劣化は大きな課題が、それが死亡時にすぐに発生してその程度は組織コレクション メソッド4,5 に関連するさまざまな要因によって仲介されます。.さらに、RNA の劣化が悪化する染色技術組織の詳細や細胞の識別を認識する必要がある場合。染色技術、ヘマトキシリン ・ エオシン、ニッスル染色などで専門的な蛍光抗体法および免疫組織化学周囲の間質から細胞の鑑別に有用が RNA を低下し、転写産物発現の変更が示されています。プロファイル6。したがって、当研究室では、死後人間の小脳のプルキンエ細胞の LCM 分離後の RNA シーケンスのため RNA を維持するために特別に設計されたステンレス プロトコルを作成しています。
LCM の新鮮凍結するティッシュを処理固定方法は必ず RNA と組織の両方の整合性を影響することができます。ホルマリン固定は形態学的保全のための標準が、架橋する原因かもしれない RNA のフラグメントし RNA 増幅7を妨げます。架橋1を誘発しない凝固定着剤として、エタノールの固定は RNA の隔離のためのより良い代替手段です。組織形態の可視化を高めるためには、キシレンは、最良の選択では、それは組織からの脂質を削除します。しかし、組織が乾燥し、レーザー キャプチャ7脆性の原因となる組織断片化になる、lcm、キシレンを利用する場合、制限知られています。キシレンはまた、揮発性の毒素と発煙のフードで正しく処理する必要があります。それにもかかわらず、キシレンは8RNA の整合性を維持しながら組織の可視化を高めるために示されています。したがって、我々 のプロトコルは 70% のエタノールの固定のエタノール脱水、キシレン潜伏形態の明快さのために続いて使用中心します。
彼らは、速度、精度、および RNA の品質が異なるに示されている異なったタイプのレーザー ベース レーザーマイクロダイ セクション システムに注意してくださいすることが重要です。赤外線 (IR) レーザーはレーザーマイクロダイ セクションと紫外線 (UV) レーザー マイクロビーム レーザーマイクロダイ セクション システムをキャプチャし、ほぼ同時に登場した8小説 LCM プラットフォームは両方でした。IR LCM システムは組織切片上に直接配置透明熱可塑性フィルムを使用して「コンタクト システム」を採用しています、興味のセル選択してフィルムに付着、集光によって IR レーザーから。また、UV LCM システムは「非接触システム」という集光レーザビームを切り取った細胞や組織興味の地域倒立か正立顕微鏡デザインのいずれかを使用して、2 つの現在利用可能な商用プラットフォームの構成に応じて組織が重力に逆らってカタパルト レーザー誘起圧力波による回収装置に取得または組織がそれぞれ、重力によって収集されます。UV LCM システムの重要な利点には、高速細胞捕捉、非接触アプローチと多く小さいレーザー ビーム直径9によるより正確な解剖汚染無料コレクションが含まれます。このプロトコルは、UV LCM システム用に設計されました、IR LCM システムでテストされていません。いずれかの UV LCM システム設計におけるコレクション キャップに蓄積細胞、観察の使用を高めるとき顕微鏡で細胞の明快さは適していません、セルはコレクション キャップに入ることになります。したがって、組織の可視化を高めるためには、我々 は液体充填コレクション キャップに対して UV LCM システムで可視の観察として設計されている不透明なコレクション キャップの使用をテストしました。液体蒸発され、顕微鏡で働いている間頻繁に交換する必要があります、液体充填コレクション キャップに挑戦することができます。時間には、キャプチャされた組織はすぐに7を溶解する RNA の安定性の重要な要因がようになります。
当研究室は、(ET) 本態性振戦患者の小脳・小脳の関連神経変性疾患の死後神経病理学的変化を研究します。我々 は仮定する私たちをリード ET ケースとプルキンエ細胞の数の減少などのコントロールを区別プルキンエ細胞を中心とした形態学的変化増加樹状回帰とさまざまな軸索の変化を示しているそのプルキンエ細胞の変性は、ET 病態10、11,12,13コアの生物学的機能です。転写プロファイルは細胞退行性変化の基になる分子基盤を探索する多くの神経疾患で使用されています。ただし、脳組織などの異種のサンプルから転写プロファイル効果的低豊富な転写産物の発現をマスクしたり、分子の変更の影響を受ける小集団でのみ発生するの検出を減少させる小脳皮質のプルキンエ細胞などの細胞。例えば、プルキンエ細胞が大幅に劣勢小脳皮質で豊富な顆粒細胞で約 1:3000;したがって、効果的にターゲットへのトランスクリプトームこれらのニューロンの特定の分離が必要です。小脳皮質は、細胞密度とセルのサイズが異なる別個の層で区切られます。この細胞アーキテクチャは、染色試薬の色素添加せず新鮮凍結組織サンプルの可視化に最適です。このプロトコルは、理論的には、同様の特徴的な組織を持つ他の組織型にも適用できる組織。
このプロトコルは、仕事人間死後の小脳プルキンエ細胞の可視化のために特別に設計されました。固定は、赤外線と紫外線の両方 – LCM の目的のための可視化と組織の多くの種類の RNA 保全を染色のため多数のプロトコルが存在します。UV LCM の実験的デザインを考えて、個人はニーズと開始と終了の材料の要件に合わせてプロトコルを調整すべき。ここでは、我々 はトランスクリプトームの高品質 RNA を準備する染色試薬を含む色素を必要とせず死後人間の小脳プルキンエ細胞を可視化するための拡張メソッドを提供するために別の LCM のプロトコルの多くの側面を組み合わせるシーケンス。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されたプロトコルは特に UV LCM の形態的に異なる組織の可視化にステンレスのアプローチに変更されます。このメソッドは、組織の可視化の強化されたレベルを維持しながら、その後直接 RNA 配列の RNA の整合性を最大化するために設計されています。ヒト組織の15の異なる分子プロファイルを理解するためのキャプチャ、可能であれば、セルの純粋な人口を作成?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は切削しこれらの実験用冷凍人間の脳組織サンプルの博士ジャン ・ ポール Vonsattel と博士エッティ コルテス、ニューヨーク脳バンクを認めると思います。著者は、本態性振戦に継続的な研究のための彼らの脳を気前よく寄付した個人を認めたいと思います。ファウスト博士と博士 Martuscello の継続的な支援とコア研究領域コロンビア大学病理・細胞生物学を認識したいと思います。著者は NIH R01 NS088257 ルイ/ファウストを認識したい) 研究は、このプロジェクトの資金調達のため。LCM 画像を共焦点で行ったし、コロンビア大学、NIH 支えのハーバート ・ アーヴィング総合がんセンターの専門顕微鏡共有リソースを付与 #P30 CA013696 (国立癌研究所)。著者らは、特殊な顕微鏡を用いた彼らの継続的な支援のテレサ Swayne とローラ Munteanu を認めるみたいと思います。
Materials
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
Referências
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