Нержавеющая протокол для высокого качества изоляции РНК от лазерного захват клеток Пуркинье Microdissected мозжечка человека Post-Mortem
Summary
Этот протокол использует пятно свободный подход для визуализации и изолировать клеток Пуркинье свежемороженые ткани от мозжечка человека посмертные через лазерный захвата microdissection. Цель настоящего Протокола заключается в том, для создания достаточного количества качественных РНК РНК последовательности.
Abstract
Лазерная захвата microdissection (LCM) является выгодным инструментом, который позволяет для коллекции обнаружения и/или фенотипически соответствующих ячеек или регионов из гетерогенных тканей. Захваченные продукт может быть использован в различных молекулярных методов для белков, ДНК или РНК изоляции. Однако сохранение РНК из ткани посмертных человеческого мозга является особенно сложным. Методы стандартных визуализации для LCM требуют гистологического или иммуногистохимическое окрашивание процедур, которые может еще больше ухудшить РНК. Таким образом мы разработали нержавеющей протокол для визуализации в LCM с цель сохранения целостности РНК в ткани мозга человека post-mortem. Клетки Пуркинье мозжечка является хорошим кандидатом для нержавеющей визуализации, благодаря его размер и расположение характерной. Коры мозжечка имеет различные слои, которые отличаются в плотность клеток, что делает их хорошим архетип для идентификации под большим увеличением микроскопии. Клетки Пуркинье являются крупные нейроны, расположенный между гранул слоя клеток, который плотно сотовой сети мелких нейронов, и молекулярный слой, который редкий в клетки тела. Из-за этой архитектуры целесообразно использование нержавеющей визуализации. Подойдет также другие органа или ячейки системы, которые имитируют этот фенотип. Нержавеющая протокол призван исправить свежемороженые ткани с этанолом и удаление липидов с ксилол для улучшения визуализации морфологических под большим увеличением световой микроскопии. Этот протокол не учитывает другие методы фиксации и разработан специально для образцов тканей, свежемороженая, захвачен с помощью ультрафиолетового (УФ)-LCM системы. Здесь мы представляем полный протокол для разрезания и фиксации свежий замороженные посмертные тканей мозжечка человека и Очистка РНК из клеток Пуркинье, изолированные, УФ-НОК, при сохранении качества РНК для последующего РНК последовательности. В наших руках этот протокол производит исключительным уровнем сотовой визуализации без необходимости для окрашивания реагентов и урожаи РНК с большим числом целостности РНК (≥8), необходимые для профилирования транскрипционный анализ экспериментов.
Introduction
Лазерная захвата microdissection (LCM) является ценный исследовательский инструмент, который позволяет разделение патологически соответствующих клеток для последующей оценки молекулярно приводом. Использование молекулярного анализа образцов этих разнородных тканей и корреляции с патологическим и клинических данных является необходимым шагом в оценке трансляционная значение биологических исследований1. При анализе данных выражение гена РНК, использование разделов замороженные ткани очень рекомендуется, так как она позволяет за отличное качество РНК, а также максимальным количеством2. Хорошо известно, что высокое качество и количество РНК необходимы для значимых данных от РНК последовательности3. Однако при использовании РНК из ткани свежий замороженные посмертные для LCM, РНК деградации является серьезной проблемой, как это происходит сразу же после смерти и его степени опосредовано различные факторы, связанные с ткани коллекции метод4,5 . Кроме того РНК деградации усугубляется, когда методы окраски необходимо признать гистологических детали и идентификации клетки. Специализированных пятная методы, такие как гематоксилином и эозином, Ниссль пятно, иммунофлюоресценции и иммуногистохимии полезны в дифференциации клеток от окружающих стромы, но было показано, снизить РНК и изменить выражение Стенограмма 6профилей. Таким образом наша лаборатория создала нержавеющей протокол, специально предназначенных для сохранения РНК человека мозжечка посмертные для целей РНК последовательности после изоляции LCM Пуркинье нейронов.
В обработке свежий замороженные ткани для LCM, метод фиксации переменно может повлиять на целостность РНК и тканей. Формалин фиксации стандартный морфологический сохранения, но причины cross-linking который может фрагмент РНК и мешать амплификации РНК7. Фиксация этанол является лучшей альтернативой для изоляции РНК, как это коагуляционное фиксатором, который не побудить сшивки1. Для лучшей визуализации тканей морфологии, ксилол является лучшим выбором, как она удаляет липиды из ткани. Однако существуют известные ограничения при использовании ксилола в НОК, как ткани могут высохнуть и стать хрупкими вызывая ткани фрагментации после лазерной захвата7. Ксилол также летучих токсин и должно быть правильно обработаны в зонта. Тем не менее ксилол было показано для улучшения визуализации тканей, сохраняя при этом целостность РНК8. Таким образом наш протокол центров вокруг 70% этанол фиксации и дегидратации этанола, следуют ксилол инкубации для морфологических ясность.
Важно обратить внимание на различные виды microdissection лазерных систем, как они показали отличаются в скорости, точности и качества РНК. Инфракрасный (ИК) лазерный захватить microdissection и ультрафиолетового (УФ) Лазерные Микролучевой microdissection системы были оба романа LCM платформ, которые почти одновременно появились8. IR-LCM система использует «контактной системы» с помощью прозрачная пленка из термопластичного помещены непосредственно на участке ткани, и клетки интереса выборочно придерживаться фильм сосредоточены импульсы от ИК-лазер. Кроме того система УФ-НОК является «система-контакт», whereby сфокусированного лазерного пучка порезы от клетки или регионы интереса в ткани; в зависимости от конфигурации в двух имеющихся в настоящее время коммерческих платформ, использующих либо прямой или инвертированный микроскоп дизайн ткани приобретается в коллекции устройство по лазерно индуцированным давления волны, что катапульты против силы тяжести или ткани собранные под действием силы тяжести, соответственно. Значительные преимущества УФ-LCM системы включают в себя быстрее клеток приобретения, свободной от загрязнения коллекции с бесконтактным подхода и более точного рассечение из-за гораздо меньшие лазерный луч диаметром9. Этот протокол был разработан специально для системы УФ-LCM и не тестировался в системе ИК-НОК. В конструкции системы либо УФ-НОК когда накопления клеток в коллекции колпачок, использование coverslip, улучшает сотовых ясность при микроскопии не подходит, как клетки не сможет вступить в коллекции Кап. Таким образом чтобы повысить визуализации тканей, мы протестировали использование непрозрачной коллекции шапки, которые призваны выступать в качестве coverslip для микроскопических визуализации в системах УФ-НОК, против жидкости заполнены коллекции шапки. Колпачков жидкости заполнены коллекции может быть сложным, как жидкость подлежит испарения и должны быть заменены часто во время работы в Микроскоп. Время становится важным фактором стабильности РНК, как захваченных ткани растворяет сразу7.
Наша лаборатория изучает посмертных neuropathologic изменения в мозжечке больных с необходимым тремор (ET) и смежных нейродегенеративных расстройств мозжечка. Мы продемонстрировали морфологических изменений, сосредоточены на клетки Пуркинье, которые отличают ET дела против контроля, в том числе уменьшение количества клеток Пуркинье, увеличение дендритных регрессии и разнообразные аксональное изменений, ведущих нас постулат что Пуркинье дегенерации клеток является основной функцией биологических ET патогенеза10,11,12,13. Транскрипционный анализ профиля используется во многих неврологических заболеваний исследовать основные молекулярные основы дегенеративных клеточных изменений. Однако транскрипционный анализ профилей из гетерогенных образцов, таких как ткани областях мозга, могут действенно маска выражение низкой изобилие стенограммы и/или уменьшить обнаружения молекулярных изменений, которые происходят только в небольшой численностью населения пострадавших клеток, таких как клетки Пуркинье в коре мозжечка. Например клетки Пуркинье значительно превосходили клетками обильные гранул в коре мозжечка, приблизительно в избытке; Таким образом чтобы эффективно целевой их транскриптом требует конкретных изоляции этих нейронов. Коры мозжечка, разделенное на различные слои, которые отличаются в ячейке плотность и размер ячейки. Эта Сотовая архитектура идеально подходит для визуализации в образец ткани, свежемороженая без красителя содержащих окрашивание реагентов. В теории, этот протокол может также применяться к другим типам ткани, которые имеют аналогичные отличительные ткани Организации.
Этот протокол был разработан для работы специально для визуализации клеток Пуркинье в мозжечок человека посмертные. Для фиксации, окрашивание визуализации и РНК сохранение многих видов тканей для целей из обоих ИК – и УФ-LCM существуют многочисленные протоколы. При созерцая экспериментальный дизайн для УФ-НОК, лиц следует адаптировать их протокол для наилучшего нужд и потребностей, начиная и заканчивая материалы. Здесь мы объединяем многие аспекты различных протоколов LCM, чтобы предоставить метод расширения для визуализации клеток Пуркинье трупа человека мозжечка без необходимости краски, содержащие окрашивание реагентов для подготовки высококачественных РНК транскриптом последовательности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокола, представленные здесь специально изменены нержавеющей подход в визуализации морфологически различные ткани для УФ-НОК. Этот метод предназначен для обеспечения максимальной целостности РНК для последующих прямой последовательности РНК, сохраняя при этом повышенный уровен?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать банк Нью-Йорка мозга, д-р Жан Поль Vonsattel и доктор Etty Кортес, за их помощь в резки и сохранения замороженных человеческий мозг образцов ткани для этих экспериментов. Авторы хотели бы признать лица, которые щедро пожертвовал их мозг для продолжающихся исследований в важнейших тремор. Доктор Фауст и д-р Martuscello хотели бы признать Колумбийского университета Департамента патологии и клеточной биологии, за их неизменную поддержку и основных космических исследований. Авторы хотели бы признать NIH R01 NS088257 Луи/Фауст) для финансирования научных исследований для этого проекта. LCM изображения были исполнены в Confocal и специализированных микроскопии общий ресурс Герберта Ирвинга всеобъемлющем онкологический центр в Колумбийском университете, поддерживаемых NIH Грант #P30 CA013696 (Национальный институт рака). Авторы хотели бы признать Тереза Swayne и Лаура Мунтяну за их постоянную помощь с специализированными микроскопии.
Materials
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
Referências
- Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
- Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97 (2006).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. . Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , (2018).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Graeme, M. I. . Laser Capture Microdissection. Third edn. , (2018).
- Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
- Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
- Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , 3297-3307 (2007).
- Louis, E. D., et al. Neuropathologic findings in essential tremor. Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Jensen, E. Laser Capture Microdissection. The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).
- Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
- Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).
- Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533 (2016).
- . . Carl Zeiss Microscopy. , (2012).
