Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Summary

Dieses Protokoll verwendet einen fleckenfreie Ansatz zu visualisieren und Purkinje-Zellen im Tiefkühlfrische Gewebe von Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn per Laser Capture Microdissection zu isolieren. Der Zweck dieses Protokolls ist, ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA für die RNA-Sequenzierung zu generieren.

Abstract

Laser Capture Microdissection (LCM) ist ein Vorteil, die für die Sammlung von zytologisch und/oder phänotypisch relevanten Zellen oder Regionen von heterogenen Gewebe ermöglicht. Erfasste Produkt kann verwendet werden, in einer Vielzahl von molekularen Methoden für Protein, DNA oder RNA isoliert. Erhaltung der RNA aus Post-mortem Gehirngewebe ist jedoch eine besondere Herausforderung. Immunhistochemische Färbung Verfahren, die weiter verschlechtern RNA oder Standard Visualisierungstechniken für LCM erfordern histologische. Daher haben wir ein Edelstahl-Protokoll zur Visualisierung in LCM mit dem Verwendungszweck der Erhaltung der Integrität der RNA in Post-Mortem Gehirngewebe entwickelt. Die Purkinje-Zelle des Kleinhirns ist ein guter Kandidat für Edelstahl-Visualisierung, aufgrund seiner Größe und charakteristischen Lage. Die zerebelläre Kortex besteht aus unterschiedlichen Schichten, die sich in Zelldichte unterscheiden, so dass sie eine gute Archetyp, unter starker Vergrößerung Mikroskopieren zu identifizieren. Purkinje-Zellen sind große Neuronen liegt zwischen Granulat Zellschicht, die dicht Mobilfunknetz kleinen Neuronen, und die molekulare Schicht, die in Zellkörpern spärlich ist. Wegen dieser Architektur ist der Einsatz von Edelstahl Visualisierung möglich. Geeignet wäre auch andere Organ oder eine Zelle Systeme, die diesen Phänotyp zu imitieren. Das Edelstahl-Protokoll soll fix Tiefkühlfrische Gewebe mit Ethanol und Lipide mit Xylol für verbesserte morphologische Visualisierung unter hoher Vergrößerung Lichtmikroskopie zu entfernen. Dieses Protokoll nicht für andere Fixierung Methoden berücksichtigt und ist speziell für Tiefkühlfrische Gewebeproben mit einer ultravioletten (UV) erfasst-LCM-System. Hier präsentieren wir Ihnen eine vollständige Protokoll für schneiden und Festsetzung von frisch gefrorenen Post-Mortem-zerebelläre Gewebe und Reinigung der RNA von Purkinje-Zellen, die durch UV-LCM, unter Beibehaltung der RNS-Qualität für die anschließende RNA-Sequenzierung isoliert. In unseren Händen dieses Protokoll produziert außergewöhnliches Maß an zellulären Visualisierung ohne Reagenzien Färbung und RNA mit hoher RNA Integrität Zahlen (≥8) ergibt, Bedarf für transkriptionelle Profilerstellung Experimente.

Introduction

Laser Capture Microdissection (LCM) ist eine wertvolle Recherche-Tool, die die Trennung der pathologisch relevanten Zellen für Molekular angetriebenen Folgebewertung ermöglicht. Die Verwendung von molekularen Analysen in dieser heterogenen Gewebeproben und die Korrelation mit pathologischen und klinischen Daten ist ein notwendiger Schritt bei der Bewertung der translationalen Bedeutung der biologischen Forschung¹. Bei der Analyse der Genexpressionsdaten aus RNA die Verwendung von gefrorenen Gewebeschnitte wird dringend empfohlen, denn es ermöglicht eine ausgezeichnete Qualität der RNA sowie Menge²maximiert. Es wurde auch festgestellt, dass hohe Qualität und Quantität der RNA Voraussetzung für aussagekräftige Daten aus RNA Sequenzierung^{3 sind}. Jedoch ist bei Verwendung von RNA aus frisch gefrorenen Post Mortem Gewebe für LCM RNA-Abbau eine große Herausforderung, da es sofort nach Tod tritt und seine Ausdehnung wird durch verschiedene Faktoren im Zusammenhang mit dem Gewebe Sammlung Methode^{4,5 vermittelt} . Darüber hinaus ist RNA-Abbau noch verschärft, wenn befleckenden Techniken erforderlich sind, um histologische Details und Zelle Identifikation zu erkennen. Spezialisiert, Färbetechniken wie Hämatoxylin und Eosin, Nissl Fleck, Immunfluoreszenz und Immunohistochemistry sind hilfreich bei der Differenzierung von Zellen aus umgebenden Stroma aber haben gezeigt, dass RNA abgebaut und Protokoll-Ausdruck ändern Profile-⁶. Daher hat unser Labor ein Edelstahl Protokoll speziell für RNA in Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn für die Zwecke der RNA Sequenzierung nach LCM Isolierung des Purkinje Neuronen erhalten erstellt.

Bei der Verarbeitung von frischen gefrorenen Gewebes für LCM, beeinflussen die Befestigungsmethode variabel RNA und Gewebe Integrität. Formalin-Fixierung ist standard für morphologische Erhaltung, aber Ursachen Vernetzung, die möglicherweise fragment RNA und RNA Amplifikation⁷stören. Ethanol-Fixierung ist eine bessere Alternative zur RNA-Isolierung, wie es ein coagulative Fixiermittel, die nicht vernetzende¹induziert wird. Um die Darstellung der Morphologie der Gewebe zu erhöhen, ist Xylol die beste Wahl, da es Fette aus dem Gewebe entfernt. Allerdings gibt es Grenzen bekannte bei Xylol in LCM, wie das Gewebe können austrocknen und spröde verursacht Gewebe Fragmentierung auf Laser Capture⁷geworden. Xylol ist auch ein flüchtiger Toxin und muss in einer Dampfhaube richtig behandelt werden. Xylol ist dennoch nachweislich um Gewebe Visualisierung Beibehaltung auch RNA Integrität⁸zu verbessern. Daher konzentriert sich unser Protokoll auf die Verwendung von 70 % Ethanol Fixierung und Ethanol Dehydrierung, gefolgt von Xylol Inkubation für morphologische Klarheit.

Es ist wichtig, die verschiedenen Arten von lasergestützten Mikrodissektion Systeme, beachten, wie sie gezeigt haben, unterscheiden sich in Geschwindigkeit, Präzision und RNS-Qualität. Infrarot (IR) Laser capture Mikrodissektion und ultravioletten (UV) Laser Microbeam Microdissection Systeme waren beide neuartigen LCM-Plattformen, die fast gleichzeitig⁸entstanden. Die IR-LCM-System nutzt eine “Kontakte-System” mit einer transparenten thermoplastischen Folie direkt auf das Gewebe-Abschnitt platziert, und Zellen von Interesse gezielt einhalten des Films durch gezielte Impulse aus einem IR-Laser. Alternativ ist das UV-LCM-System ein “non-Contact-System”, wobei ein fokussierten Laserstrahl entfernt die Zellen oder Regions of Interest im Gewebe schneidet; abhängig von der Konfiguration in zwei derzeit verfügbaren kommerziellen Plattformen, die entweder eine invertierte oder aufrechte Mikroskop-Design verwenden, Gewebe wird in einer Sammelvorrichtung durch eine Laser-induzierte Druckwelle, die es gegen die Schwerkraft katapultiert erworben oder Gewebe ist gesammelt durch die Schwerkraft, beziehungsweise. Wesentliche Vorteile des UV-LCM-Systems zählt schneller Zelle Erwerb, kontaminationsfrei Sammlung mit dem berührungslosen Ansatz und genauere Zergliederung durch eine viel kleinere Laser Beam Durchmesser⁹. Dieses Protokoll wurde speziell für ein UV-LCM-System und nicht in einem IR-LCM-System getestet wurde. In beiden UV-LCM-System-Design wenn Anhäufung Zellen in die Sammlung-Kappe, die Verwendung von einem Deckgläschen, die verbessert ist zellulären Klarheit während Mikroskopie nicht geeignet, da die Zellen nicht in der Lage, die Sammlung GAP einzugehen wäre. Daher haben wir getestet um Gewebe Visualisierung zu erhöhen, die Verwendung von undurchsichtigen Sammlung Caps, die als ein Deckglas für mikroskopische Visualisierung in UV-LCM-Systeme gegen Flüssigkeit gefüllte Sammlung Kappen dienen sollen. Flüssigkeit gefüllten Sammlung Kappen können schwierig sein, da die Flüssigkeit unterliegt der Verdunstung und häufig während der Arbeit am Mikroskop ausgewechselt werden. Zeit ist ein wichtiger Faktor für RNA-Stabilität, wie das aufgenommene Gewebe sofort⁷auflöst.

Unser Labor untersucht die Post-mortem neuropathischem Änderungen in das Kleinhirn von Patienten mit essentiellem Tremor (ET) und verwandte neurodegenerativen Erkrankungen des Kleinhirns. Wir haben gezeigt, dass morphologische Veränderungen auf Purkinje-Zellen, die ET Fällen im Vergleich zu Kontrollen, einschließlich einer reduzierten Anzahl von Purkinje-Zellen unterscheiden zentriert dendritischen Regression und eine Vielzahl von axonale Veränderungen führt uns zu postulieren, dass Purkinje Zelldegeneration ist eine biologische Kernfunktion ET Pathogenese^10,11,12,13. Transkriptionelle Profilierung wurde in viele neurologische Erkrankungen eingesetzt, um die zugrunde liegenden molekulare Grundlagen der degenerativen Zellveränderungen zu erkunden. Doch transcriptional Profile aus heterogenen Proben, wie Gewebe Hirnregionen, können wirksam Maske den Ausdruck der niedrigen Fülle Transkripte und/oder vermindern die Erkennung von molekularen Veränderungen, die nur in eine kleine Population von betroffenen auftreten Zellen, wie Purkinje-Zellen im Kleinhirn Kortex. Beispielsweise sind der Purkinje-Zellen erheblich durch die reichlich Granulat-Zellen im Kleinhirn Cortex von ca. 1:3000 Unterzahl; so effektiv auf erfordert ihre Transkriptom spezielle Isolierung dieser Neuronen. Zerebelläre Kortex ist durch unterschiedliche Schichten abgegrenzt, die in Zelle Dichte und Größe der Zellen unterscheiden. Diese zellulären Architektur ist ideal, um in eine Tiefkühlfrische Gewebeprobe ohne Farbstoff-haltigen Färbung Reagenzien zu visualisieren. In der Theorie könnte dieses Protokoll auch angewendet werden, auf anderen Gewebetypen, die ähnlich markanten Gewebe haben Organisation.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um speziell für Purkinje Zelle Visualisierung im Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn zu arbeiten. Zahlreiche Protokolle gibt es für die Befestigung, Visualisierung und RNA Erhaltung vieler Arten von Geweben für die Zwecke der beiden IR und UV-LCM Färbung. Wenn ein experimentelles Design für UV-LCM erwägen, sollten Einzelpersonen ihr Protokoll passen am besten die Bedürfnisse und Anforderungen von beginnend und endend Materialien anpassen. Hier verbinden wir viele Aspekte der verschiedenen LCM-Protokolle ermöglichen eine verbesserte Methode zur Visualisierung von Purkinje-Zellen im menschlichen Kleinhirn Post-Mortem-ohne die Notwendigkeit des Farbstoffes mit Färbung Reagenzien, qualitativ hochwertige RNA Transkriptom vorzubereiten Sequenzierung.

Protocol

Alle humanen Proben, die in diesem Protokoll genutzt mit Einwilligung gewonnen wurden und durch die internen Review Board (IRB) an der Columbia University und der Yale University genehmigt worden. Hinweis: Die Gesamtheit dieses Protokolls sollte folgen strengen RNA Umgang mit Richtlinien, wobei eine behandschuhte Hand wird immer verwendet, alle Flächen mit einer RNase Dekontaminator gereinigt werden und alle Arbeitsmaterialien RNA/DNA/Nuklease frei sind. <p class="jove_ti…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die Zubereitung von frisch gefrorenen Post-Mortem-menschlichen Hirngewebe für UV-LCM. Gründliche technische Daten und Anmerkungen sind für Kryostat schneiden, angegeben, da es frisch gefrorenen Hirngewebe mit einem hohen Maß an Präzision schneiden schwierig sein kann. Der wichtigste Punkt ist, dass frisches gefrorenes Gewebe extrem kalt ist und eine erhebliche Menge an Zeit erfordert, um auf die wärmere Temperatur von einem Kryostat zu a…

Discussion

Die hier vorgestellten Protokoll ist speziell geändert, um einen rostfreien Ansatz bei der Visualisierung von morphologisch unterschiedlichen Gewebes für UV-LCM. Diese Methode soll die Integrität der RNA für die anschließende direkte RNA Sequenzierung, unter Beibehaltung einer Steigerung des Niveaus der Gewebe Visualisierung zu maximieren. Die Fähigkeit, verschiedene Zelltypen für Erfassung, erstellen die reinste Population von Zellen möglich ist, zu unterscheiden ist wichtig für das Verständnis der unterschied…

Materials

MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.