Hier introduceren we een methode voor het gebruik van een intra-ventrikel optische katheter in geperfundeerd harten om Absorptie spectroscopie uit te voeren over de hart muur. De verkregen gegevens bieden robuuste informatie over de zuurstofspanning van het weefsel, evenals substraat gebruik en membraanpotentiaal gelijktijdig met cardiale prestatie maatregelen in deze alomtegenwoordige voorbereiding.
Absorptie spectroscopie van de hartspier biedt niet-destructieve beoordeling van cytosolische en mitochondriale oxygenatie via myoglobine en cytochroom-extinctie respectievelijk. Daarnaast kunnen ook talrijke aspecten van de mitochondriale metabole status zoals membraanpotentiaal en substraat invoer worden geschat. Om cardiale wand transmissie optische spectroscopie uit te voeren, wordt een in de handel verkrijgbare zijwaarts gerichte optische vezel katheter in de linker ventrikel van het geïsoleerde geperfundeerd hart als een lichtbron geplaatst. Licht dat door de hart muur loopt wordt opgevangen met een externe optische vezel om optische spectroscopie van het hart in near real-time uit te voeren. De transmissie aanpak vermijdt talrijke oppervlakte verstrooiing interferentie die zich voordoet in veel gebruikte reflectie benaderingen. Veranderingen in Transmurale extinctie Spectra werden deconvolved met behulp van een bibliotheek van chromofoor referentie spectra, die tegelijkertijd kwantitatieve maatregelen van alle bekende hart chromoforen kregen. Deze spectrale deconvolutie benadering elimineerde intrinsieke fouten die kunnen voortvloeien uit het gebruik van gemeenschappelijke dubbele golflengte methoden die worden toegepast op overlappende absorptiespectra, evenals een kwantitatieve evaluatie van de goedheid van pasvorm. Een aangepast programma is ontworpen voor het verzamelen en analyseren van gegevens, waardoor de onderzoeker de metabole toestand van het preparaat tijdens het experiment kon controleren. Deze relatief eenvoudige toevoegingen aan het standaard hart perfusie systeem bieden een uniek inzicht in de metabole toestand van de hart muur naast conventionele maatregelen van contractie, perfusie en substraat/zuurstof extractie.
Optische extinctie spectroscopie voor bewaking intact orgel biochemie is een veel gebruikte benadering vanwege de intrinsieke, niet-destructieve natuur1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobine extinctie biedt een meting van de gemiddelde cytosolische zuurstofspanning10,11,12. Mitochondriale cytochromen geven informatie met betrekking tot substraat binnenkomst op het niveau van flavins, membraan potentieel van cytochroom bL: bH13, en zuurstof levering aan de mitochondriën in de cel van cytochroom oxidase (Cox ) redox staat14. Glancy et al. toonde aan dat de activiteiten van elke complexen kunnen worden bepaald door het meten van het Mitochondriale membraanpotentiaal en de metabolische snelheid15. Vandaar, met behulp van optische spectroscopie, een schat aan informatie kan worden verkregen zonder de noodzaak van exogene sondes of belangrijke wijzigingen van de huidige studie systemen. Het doel van dit papier is om een robuuste methode te presenteren voor het opvangen van optische spectra in conventionele geperfundeerd hart preparaten, waarbij de enige grote modificatie studies uitvoert in een verduisterde omgeving.
Reflectantie Absorptie spectroscopie is met succes gebruikt voor het uitvoeren van optische spectroscopie van de geperfundeerd hart3,6,16,17,18,19 ook Als het hart in vivo1. Reflectantie spectroscopie bestaat uit het branden van licht op het hart oppervlak en het verzamelen van het licht verspreid door het hart, evenals diffuus en spiegelend reflecterend licht. Zo is het verzamelde licht in deze benadering een samenstelling van meerdere verstrooiings mechanismen en het weefsel chromofoor gemiddelde van belang. Als gevolg van de beweging en het complexe oppervlak van het hart, de lichtreflectie van het oppervlak van het hart is bijzonder problematisch, het veranderen van de diepte van penetratie en de hoeveelheid zuiver gereflecteerd licht.
De hierboven gepresenteerde beperkingen van de absorptie spectroscopie met reflectantie werden opgelost door een optische katheter in de linker ventrikel holte te introduceren, waardoor de verzameling van verzonden licht over de linker ventrikel vrije muur20. De voordelen van transmissie spectroscopie voor dit type studie werden gewaardeerd in vroege invasieve studies van Tamura et al.9 de huidige implementatie biedt een zeer robuuste transmissie Absorptie spectroscopie analyse van het intact hart met met betrekking tot cytosolische oxygenatie en mitochondriën redox toestand onder een verscheidenheid van voorwaarden21. Deze eerste studies gebruikten een speciaal vervaardigde katheter met een gevoede LED op de tip gericht om een zijwaarts afvuren patroon van wit licht door het myocardium te genereren. Echter, de relatief grote LED getipt katheter is alleen geschikt voor gebruik op middelgrote harten (konijn, cavia, enz.) en vereist aangepaste fabricage. In de huidige studie, een methode van het gebruik van een commercieel beschikbare 200-micron kern kant-vuren optische vezels als een lichtgeleider wordt gepresenteerd. In plaats van een bekabelde LED aan de tip, de katheter met de 500-micro Tip redirects licht van een externe bron waardoor de veelzijdigheid van het systeem. Deze aanpak maakt het gebruik van een breed scala van externe lichtbronnen, waaronder lasers voor toepassingen zoals Raman verstrooiing spectroscopie. Om deze gegevens te kwantificeren, wordt een online volledige spectrale analyse met behulp van bekende referentie Spectra ter verbetering van de nauwkeurigheid van de spectroscopische bepaling van hart chromoforen gepresenteerd zoals eerder beschreven20,22. De broncode voor deze analyse wordt op verzoek door de auteurs verstrekt. Met behulp van deze aanpak, informatie over cardiale biochemie en mitochondriale functie kan gelijktijdig worden verkregen met de conventionele cardiale functionele parameters met weinig of geen invloed op de hart voorbereiding. Omdat het hart kritisch afhankelijk is van de mitochondriale functie en de zuurstoftoevoer, zal deze technische toevoeging aan het klassieke geperfundeerd hartsysteem de interpretatie en het nut van dit belangrijke model van cardiale prestaties aanzienlijk verbeteren.
De geïsoleerde retrograde of werkende geperfundeerd hart voorbereiding is een Mainstay in de studie van cardiale fysiologie, evenals het preklinisch onderzoek van technieken en geneesmiddelen op het hart. Sleutel tot het gebruik ervan was het gemak van de voorbereiding, robuuste functionele kenmerken en controle van experimentele parameters, evenals de mogelijkheid om veel functionele parameters van het kloppend hart te meten. Optische extinctie spectroscopie biedt inzicht in weefsel oxygenatie, evenals mitochondriën metabole activiteiten. Optische spectroscopie is voornamelijk uitgevoerd in de geïsoleerde geperfundeerd hart studies in de reflectie modus die moeilijk te interpreteren is als gevolg van bewegings-en lichtverstrooiings complicaties.
We hebben ventrikel Wall Transmission Optical spectroscopie (vwtos) geïntroduceerd om een robuuste methode te bieden voor het bewaken van metabolische chromophores in het hartweefsel. In een eerdere publicatie toonden we aan dat een LED die met de punt van de coaxkabel20 is bedraad een unieke, intracardiale, zijwaarts afvuren lichtbron maakt die gebruikt kan worden voor vwtos geperfundeerd Hearts. De zijwaarts afvuren verwijst naar de projectie van licht loodrecht op de lange as van de katheter, ideaal voor het verlichten van de vrije wand van de ventrikel. De LED-katheter was klein genoeg om de cardiale functie niet te beïnvloeden, maar vereiste gespecialiseerde fabricage in het laboratorium. De huidige studie presenteert het gebruik van een 500 micron commerciële zijwaarts afvuren katheter die kan worden gekoppeld aan elke lichtbron compatibel met Fiber Optics. Deze zijwaarts gerichte optische katheters werden commercieel ontwikkeld voor laser ablatie loodrecht op de lange as van de vezel. Natuurlijk gebruiken we lichtkracht veel lager dan nodig is voor foto ablatie. Kleinere vezels zijn beschikbaar voor gebruik op kleinere preparaten, zoals de geperfundeerd muis Heart27. Dit glasvezel systeem voorzag in een adequate verlichting door de hart Muur in het golflengtebereik waar hartchroophores absorberen (450 – 630 nm). Met behulp van een pick-up Fiber Optic aan de buitenkant van het hart, de absorptie van myoglobine en mitochondriën cytochromen kan worden bewaakt met uitstekende temporale en spectrale resolutie (Zie Figuur 5). De zijwaarts gerichte glasvezel benadering heeft verschillende voordelen ten opzichte van de LED-katheter voor VWTO’S, waaronder een veel kleiner transversale Profiel van de katheter dat de impact van de katheter op het hart minimaliseert, flexibelere vermindering van de impact op de hartklep en ventrikel prestaties, geen elektrische verbindingen die kunnen kort in de Saline perfusate, en ten slotte een katheter die gebruikmaakt van een externe lichtbron die de flexibiliteit van de selectie van de lichtbron voor VWTOS verhoogt.
Vanwege de sterke absorptie van het hart onder 490 nm is het moeilijk om veel informatie te genereren over de Soret-band van de cytochromen in het gebied van 410 – 445 nm of NADH bij 340 nm. Zo is de brede extinctie van FAD bij 450 nm de laagste frequentie absorptie die wordt waargenomen, hoewel de gehele absorptie piek van deze chromophores niet wordt bemonsterd. Met behulp van VWTOS de signaal-ruis verhouding is zeer hoog als de hele muur wordt bemonsterd in tegenstelling tot oppervlaktereflectie spectroscopie, vaak gebruikt20, die alleen het oppervlak van het hart met talrijke verstrooiings problemen monsters. VWTOS sampling de hele hart Muur is meer analoog aan nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMRS) maatregelen van vele cardiale metabolieten zoals 31P gedetecteerd adenosinetrifosfaat en creatine fosfaat28, 13C gedetecteerd gelabelde metabolieten29,30 inclusief hypergepolariseerde etiketten31,32pt 1H gedetecteerd metabolieten33. Omdat de VWTO’S kunnen worden uitgevoerd met behulp van niet-magnetische apparaten, is het volledig haalbaar dat NMR en VWTO’S gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd. VWTOS is niet beperkt tot endogene chromoforen en kan worden gebruikt om de absorptie van optische voelers voor pH, CA2 +en plasma membraanpotentiaal te bewaken.
We gebruiken 2 Hz (d.w.z. 2 samples/sec) die een uitstekend single-spectrum signaal naar ruis bieden. Hoewel hogere bemonsteringsfrequenties kunnen worden bereikt die cardiale cyclus analyse toestaan, hebben eerdere studies aangetoond dat er geen beat is om variatie in de chromofoor-extinctie te verslaan, dus geen inspanning om selectief licht te verzamelen als een functie van cardiale cyclus was gemaakt34. Door de VWTOS-geometrie is de detectie van licht minder afhankelijk van weefsel beweging dan reflectie methoden, omdat de complexe oppervlakte verstrooiing gebeurtenissen worden geëlimineerd. We vinden dat ernstige beweging deze maatregelen kan verstoren, maar de real-time spectrale analyse onthult snel spectrale overgangen die inconsistent zijn met weefsel chromofoor-overgangen. Nogmaals, dit gebeurt alleen wanneer het hart op grove wijze beweegt van de verzamel vezel drastisch verminderen van de hoeveelheid opgevangen uitgezonden licht.
De vwtos-gegevens worden geanalyseerd met behulp van een volledige spectrale aanpassings routine op basis van een referentie bibliotheek van spectra van cardiale chromophores en het spectrum van de lichtbron zoals eerder beschreven20,22,27, 35 met een eenvoudige lineaire kleinste kwadraten benadering. Deze spectrale fitting procedure compenseerde het overlappende extinctie spectrum en vertrouwt niet op “isobestic” golflengten. Deze volledige spectrum analyse elimineert artefacten die zijn gekoppeld aan gemeenschappelijke dubbele straal (d.w.z. twee golflengte) analyse1,3,6 waarvan is aangetoond dat het problematisch is20. Het extra voordeel van een volledige spectrale analyse is het genereren van een goedheid van pasvorm uit de restanten, niet beschikbaar in Dual Beam-protocollen.
In deze studie richtten we ons op het effect van cyanide op de optische eigenschappen van het hart. Omdat cyanide cytochroom-oxidase blokkeert, remt het het zuurstofverbruik en resulteert het in wezen in een netto reductie van alle cytochromen als de elektronen terug in de cytochroom keten. Echter, het membraan potentieel blijft blijkbaar hoog, als de redox veranderingen in bL en bH zijn zeer klein in vergelijking met cytochroom c13. Met de stopzetting van het zuurstofverbruik moet de zuurstofspanning in het weefsel de perfusaat benaderen en we merkten een vroege toename van zuurstofgehalte in myoglobine met cyanide in overeenstemming met de notie dat de zoutoplossing geperfectioneerd hart, zelfs in retrograde perfusie modi, is niet volledig zuurstofverrijkende myoglobine in de cytosol19,20,21,36. Het vergelijken van het maximale effect van cyanide op zuurstofrijk myoglobine met het volledig deoxygenated spectrum verkregen met ischemie onthult een myoglobine oxygenatie van slechts ongeveer 88%, consistent met eerdere studies.
Het is belangrijk om in deze studie te noteren dat de cyanide-effecten op myoglobine oxygenatie en cytochroom reductie tijdelijk werden opgelost. Het is verrassend dat de effecten van cyanide voor het eerst werden waargenomen op coronaire stroming en myoglobine voordat grote veranderingen in het hart cytochromen redox toestand werd waargenomen. De vroege gemarkeerde toename van de stroom suggereert dat een effect op arteriële gladde spieren24,37 kan optreden voordat de bruto metabole effecten in de hart cellen worden waargenomen. De toename van de stroom, mogelijk met een bescheiden cyanide geïnduceerde afname van de ademhaling, resulteert waarschijnlijk in de onmiddellijke toename van zuurstofgehalte myoglobine veroorzaakt door de toename van de zuurstoftoevoer. Met de verspreiding van de cyanide-remming naar de myocyten wordt een verdere toename van de coronaire stroming waargenomen (Zie de regio gemarkeerd met 3 in Figuur 5a), waarschijnlijk gedreven door talrijke metabole factoren38. De grote vroege impact van cyanide op stroming suggereert dat het metabolisme van de vasculaire gladde spier krachtiger kan zijn bij het veranderen van de vasculaire Toon dan het metabolisme van de myocyten. Deze gegevens ondersteunen de gevestigde opvatting dat myoglobine een veel lagere affiniteit heeft voor zuurstof dan COX, zelfs in het intacte hart, omdat myoglobine oxygenatie zich goed voordeed voor veranderingen in mitochondriën redox toestand (Figuur 5). Dit hoge niveau van deoxygenated myoglobine onder controle omstandigheden is consistent met eerdere studies die suggereren dat het geïsoleerde fysiologische zoutgehalte gedeeltelijk hypoxische kan zijn, zelfs onder controle omstandigheden9,19, 20,21,27,36, onderstrepen het belang van het monitoren van cardiale weefsel oxygenatie bij het gebruik van dit belangrijke model in cardiale fysiologie.
We presenteren hier de experimentele Details voor het uitvoeren van transmissie Absorptie spectroscopie op de geïsoleerde geperfectiongebruikt hart. We hebben deze techniek met succes aangepast voor gebruik op de harten van het konijn naar de muis met behulp van een dunne zijwaarts afvuren intracardiale optische vezel. Gebruikmakend van State of the art volledige spectrale fitting routines, kan de complexe optische interactie van de cardiale chromophores gemakkelijk worden geëxtraheerd, waardoor een near real-time meting van kritische elementen van het myocardiale metabolisme gelijktijdig met conventionele functionele maatregelen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd volledig ondersteund door het NHLBI intramurale programma (project # ZIA HL00460131).
BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |