Основная культура клеток коры надпочечников крыс и анализов стероидогенных функций
Summary
Гормон коры надпочечников является жизненно важным для животных против стресса и болезней. Здесь мы представляем протокол к культуре первичных крыса клеток надпочечников. Это может быть хорошей в пробирке платформой для изучения механизмов реагента интерес к надпочечниковой стероидогенеза и биосинтеза липидов.
Abstract
Гормон, который выделяет коры надпочечников является жизненно важным для животных против стресса и болезней. Метод, описанный здесь является процедура первичного культивировали крыса клеток надпочечников и смежных функциональных анализов (иммунофлюоресценции окрашивание липидного капель поверхности белка, а также анализ кортикостерона). В отличие от в естественных условиях модели колебания interexperiments в культурах надпочечников монослоя меньше и экспериментальные условия легко контролировать. Кроме того источник крыс также является более стабильным, чем других животных, как говядину из них. Есть также несколько линий клеток человека надпочечников (NCI-H295, NCI-H295R, под ключ SW13 и т.д.), которые могут использоваться в исследованиях, надпочечников. Однако стероидов производства этих линий по-прежнему будут определяться многочисленных факторов, которые включают сыворотки номер партии, номер прохода, мутант/потеря отдельных генов, и т.д. За исключением хватает 17α-гидроксилазы, основная культура клеток коры надпочечников крыс методика лучше и более удобным для изучения физиологии надпочечников. В резюме основной крыса надпочечников культур может быть хорошо в пробирке платформой для исследователей для изучения механизмов реагента интерес к системе надпочечника.
Introduction
Эндокринная система отвечает за регулирование физиологической деятельности и гомеостаза1. Надпочечных желез, расположенных в черепной полюса почки являются одним из крупных эндокринных органов, которые выделяют mineralocorticoids, глюкокортикоидов и андрогенов2,3. Существует два отдельных частей надпочечника: коры и мозгового вещества. Надпочечников состоит из трех слоев: внешняя glomerulosa, промежуточных fasciculata и внутренняя reticularis3. Glomerulosa зона-это оригинальный сайт секреции альдостерона, минералокортикоиды, которая помогает в реабсорбции ионов натрия и воды в почках3. Zona fasciculata главным образом производит базальный уровень глюкокортикоидов в нормальных физиологических условиях3. Кортикостероиды в грызунов и кортизола в организме человека действовать, чтобы помочь телу в преодолении стресса, регулируя глюкозы крови3. В некоторой степени они подавляют воспалительные реакции и регулировать иммунную систему4,5. В отличие от других млекопитающих, мышей и крыс не имеют функциональный zona reticularis из-за отсутствия выражения 17α-гидроксилазы в надпочечника6,7. Таким образом надпочечники от мышей и крыс лишены секрецию надпочечников C-19 стероиды (кортизола и надпочечников андрогены).
Первичной клетки культивировали адренокортикальной было показано, чтобы быть полезным для изучения механизмов, контролирующих надпочечников физиологии8. Как другие стероидогенных тканях каждой зоне коры надпочечников синтезирует стероидов из свободного холестерина9. Адренокортикотропный гормон (АКТГ) стимуляции свободный холестерин освобождается от пробоя липидного капель и, таким образом, повышает стероидов производства в fasciculata и reticularis10.
Многие группы пытаются установить стабильных клеточных линий от адренокортикальной карциномы. Однако некоторые проблемы ограниченное использование адренокортикальной клеточных линий и в пробирке модели8. Стероидных ответы клеточных линий могут отличаться между проходы, номер лота сыворотки и качество сыворотки, и т.д. Кроме того коммерческие надпочечников клеточных линий (Y1 и под ключ SW13) не выделяют кортикостерона, что делает его более трудным для изучения надпочечников стероидогенеза8. С помощью надпочечников крупного рогатого скота и лошадей, как ex vivo модели могут быть хорошим выбором, даже несмотря на то, что ткани из этих рынков может скрывать некоторые неизвестные риски. По сравнению с ними, управление крыса надпочечники легче и источник относительно более стабильной и свободной от возбудителя. Вместе взятые, нынешний метод, описанный здесь могут использоваться для расследования соответствующих механизм синтеза кортикостерона в клетках надпочечников fasciculata крыса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Адреналиновые железы играют ключевую роль в экологической адаптации3. Гормон, который выделяет коры надпочечников может регулировать и регулировать физиологические функции и гомеостаза3. В естественных условиях модель отражает реальные физиологические эфф?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом от Тайваня Совета национальной науки (NSC102-2320-B-037-008-MY3) и национальной Ченг Кунг университет больницы исследовательский грант (NCKUH-10102045).
Materials
| female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| forceps | BRAUN | BD331R | |
| scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| inverted light microscopy | Leica | ||
| fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. . Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
