Polyacrylamide jeller içinde Mango-Tagged RNA floresan görselleştirme bir Poststaining yöntemi ile
Summary
Burada RNA Mango aptamers ı, II, III veya IV ile etiketlenmiş görüntü Rnas ‘ında doğal veya denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri kullanarak hassas, hızlı ve ayrımcılık sonrası jel boyama yöntemi sunuyoruz. Standart sayfa jeller çalıştırdıktan sonra, Mango-Tagged RNA kolayca TO1-biotin ile lekelenmiş ve daha sonra yaygın olarak kullanılabilir floresan okuyucular kullanılarak analiz edilebilir.
Abstract
Doğal ve denatüre Poliakrilamid jelleri, ribonukleoprotein (RNP) karmaşık mobilitesini karakterize etmek ve sırasıyla RNA boyutunu ölçmek için rutin olarak kullanılır. Birçok jel görüntüleme tekniği, spesifik olmayan lekeler veya pahalı fluorophore probları, hassas, ayrımcılık ve ekonomik jel görüntüleme metodolojileri çok tercih edilir. RNA Mango çekirdek dizileri, rasgele bir RNA kökü ile kapalıyken sadece ve pahalı olmayan bir RNA ‘ya eklenebilen küçük (19 – 22 NT) sıralı motifler. Bu mango Etiketler bağlama üzerine binlerce kez daha floresan olur TO1-biotin denilen bir thiazole-turuncu fluorophore ligand için yüksek yakınlık ve özgüllük ile bağlayın. Burada Mango ı, II, III ve IV, yüksek hassasiyetle jeller RNA özellikle görüntü için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Doğal jellerin RNA ‘nın 62,5 fmol ‘sı ve 125 fmol olarak da denatüre jeller,% 30 dakika boyunca potasyum ve 20 Nm to1-biotin içeren bir görüntüleme tamponunun içinde jel ile tespit edilebilir. Mango etiketli sistemin özgüllüğünü, toplam bakteriyel RNA ‘nın karmaşık bir karışımı bağlamında Mango etiketli 6S bakteriyel RNA ‘nın görüntülemesi ile gösteriyoruz.
Introduction
Mango (TO1-biotin, Şekil 1a) thiazole-turuncu basit türevleri için sıkıca (nanomolar bağlayıcı) bind dört küçük floresan RNA aptamers bir dizi oluşan bir RNA etiketleme sistemi,1,2,3 . Bağlayıcı üzerine, bu ligin floresans 1.000 artar-4.000-belirli aptamer bağlı olarak katlayın. Mango III, RNA Mango aptamers nanomolar bağlayıcı benzeşme ile birlikte geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP), aşan Mango sisteminin yüksek parlaklık, görüntüleme ve RNA arıtma hem de kullanılmasını sağlar kompleksleri2,4.
Mango ı5, II6ve III7 ‘ nin X-ışını yapıları yüksek çözünürlükte tespit edilmiştir ve üç aptamer, BIND to1-biotin (Şekil 1B-D) için RNA dörtlü kullanır. Tüm üç aptamerlerin kompakt çekirdeği, kompakt adaptör motifleri ile harici RNA dizisinden yalıtılır. Mango ı ve II her ikisi de kendi Mango çekirdeğini keyfi RNA Dubleks (Şekil 1B, C) ile bağlamak için esnek bir GNRA benzeri döngü adaptörünü kullanmaktadır. Bunun aksine, Mango III, çekirdeğini rasgele bir RNA heline (Şekil 1D, mor kalıntıları) bağlamak için sert bir Tripleks motif kullanır ve Mango IV ‘ün yapısı şu anda bilinmemektedir. Bu aptamerlerin her birinin ligand-bağlayıcı çekirdeği, bu helisel adaptörler tarafından harici RNA dizisinden ayrıldığı için, bunların hepsi sadece çeşitli RNAs ‘larla birleştirilebilir. Bakteriyel 6s düzenleyici RNA (Mango ı), Maya spliceosome bileşenleri (Mango ı), ve insan 5s RNA, U6 RNA, ve C/D scarna (Mango II ve IV) tüm başarıyla bu moda etiketlenmiş oldu2,8, düşündüren birçok biyolojik RNAs RNA Mango aptamer sistemi kullanılarak etiketlenebilir.
Denaturing ve yerel jelleri genellikle RNAs okumak için kullanılır. Denaturing jeller genellikle RNA boyutu veya RNA işleme yargılamak için kullanılır, ancak genellikle, bir Kuzey Blot durumunda, örneğin, bir görüntü oluşturmak için birkaç yavaş ve sıralı adımlar gerektirir. RNA ıspanak ve brokoli gibi diğer RNA fluorojenik aptamers, jel görüntüleme9için başarıyla kullanılırken, bugüne kadar hiçbir flororojenik aptamer sistemi, Mango sisteminin yüksek parlaklığını ve benzeşimine sahiptir, bu da önemli bir ilgi Mango jel görüntüleme yeteneklerini araştırmak için. Bu çalışmada, RNA Mango sisteminin sadece jel görüntülemede uzatılabilir olup olmadığını merak ettik, TO1-biotin (510 nm ve 535 Nm) uyarma ve emisyon dalga boyları (sırasıyla), en floresan için ortak olan eGFP kanalında görüntüleme için uygundur. jel tarama enstrümantasyonu.
Burada sunulan jel boyama protokolü, yerel ve denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri içinde özellikle Mango etiketli RNA moleküllerini algılamak için hızlı bir yol sağlar. Bu boyama yöntemi, potasyum ve TO1-biotin içeren bir tampon içinde jelleri içerir. RNA Mango aptamerleri bu tür yapıları stabilize etmek için G-quadruplex bazlı ve potasyum gereklidir. RNA ‘nın minimal Mango-kodlama DNA şablonlarından transkripsiyonu kullanarak (protokol bölümüne bakın), basit bir boyama protokolü kullanarak, yerel jellerin RNA ‘sında 62,5 fmol ve denatüre jeller arasında 125 fmol olarak az az tespit edebilirsiniz. Ortak nonspesifik nükleik asit lekeleri aksine (bkz: malzeme tablosu, hereon gelen SG atıfta), biz açıkça tanımlayabiliriz Mango-etiketlenmiş RNA yüksek konsantrasyonlarda toplam etiketsiz RNA örneklerde mevcut olduğunda bile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mango floresan etiketinin önemli bir avantajı, tek bir etiketin birden çok şekilde kullanılabilmesi. Bu aptamers yüksek parlaklık ve yakınlık onları sadece hücre görselleştirme2 için değil, aynı zamanda In vitro RNA veya RNP arıtma4için yararlı hale. Bu nedenle jel görüntüleme, Mango etiketinin çok yönlülüğünü basit bir şekilde genişletir. Mango jel görüntüleme hassasiyeti, Kuzey leke14 ‘ ten biraz daha azdır, ancak…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, teknik yardım ve Lena dolgosheina için el yazması redaksiyon için Razvan Cojocaru ve Amir ağahzadeh teşekkür ederiz. Bu proje için bir Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) P.J.U. için işletme hibe tarafından finansman sağlandı
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
Referências
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Bioquímica. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
