अलगाव और उच्च नमक के दत्तक हस्तांतरण antigen-प्रस्तुत dendritic कोशिकाओं का इलाज किया
Summary
यहां, हम चुंबकीय सेल छंटाई और भोली चूहों में बाद में दत्तक हस्तांतरण द्वारा murine spleens भारी से द्रुमाकृतिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । उच्च नमक सक्रिय द्रुमाकृतिक कोशिकाओं के मॉडल दत्तक हस्तांतरण और प्रवाह cytometry के कदम दर कदम प्रक्रियाओं की व्याख्या करने के लिए चुना गया था ।
Abstract
अतिरिक्त आहार नमक का सेवन सूजन के लिए योगदान देता है और उच्च रक्तचाप के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमने पहले पाया है कि antigen-प्रस्तुत द्रुमाकृतिक कोशिकाओं (डीसीएस) को ऊंचा extracellular सोडियम nadph ऑक्सीडेस और isolevuglandin के गठन (isolg) के सक्रियण के लिए अग्रणी समझ सकते है-प्रोटीन अभिअभिज्ञान । इन isolg-प्रोटीन अभिनति आत्म प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया और एक autoimmune की तरह राज्य और उच्च रक्तचाप को बढ़ावा देने के । हम विकसित और उच्च रक्तचाप में डीसी समारोह का अध्ययन करने के लिए राज्य के अत्याधुनिक तरीकों को अनुकूलित किया है । यहाँ, हम अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, ऊंचा सोडियम के साथ विट्रो उपचार में, और उच्च रक्तचाप में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में मूरीन प्लीहा CD11c+ कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण.
Introduction
अतिरिक्त आहार नमक उच्च रक्तचाप के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है । 1 , 2 अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन की सिफारिश की एक अधिकतम २,३०० मिलीग्राम (मिलीग्राम) सोडियम की (ना+) प्रति दिन सेवन, तथापि; अमेरिका की जनसंख्या का 10% से कम इस सिफारिश का पालन करता है । 3 , ना में 4 मामूली कटौती+ सेवन कम रक्तचाप और कोरोनरी हृदय रोग और स्ट्रोक के वार्षिक नए मामलों में अमेरिका में 20% से कम । 5 अधिक नमक की खपत के साथ एक बड़ी समस्या यह है कि हाइपरटेंसिव जनसंख्या का ५०% नमक संवेदनशीलता दर्शाती है, रक्तचाप में 10 mmhg वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया है ना+ लोड हो रहा है या रक्तचाप में एक समान ड्रॉप के बाद ना+ प्रतिबंध और डायर्सी । 6 नमक-संवेदनशीलता भी normotensive व्यक्तियों के 25% में होता है, और मौत और हृदय की घटनाओं का एक स्वतंत्र कारक है । 7 , 8 नमक-गुर्दे से जुड़े उच्च रक्तचाप में तंत्र संवेदन अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है; हालांकि, हाल के अध्ययनों से सुझाव है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं नहीं समझ+कर सकते हैं । 9 , 10
हाल के सबूत से पता चलता है कि अतिरिक्त में परिवर्तन-गुर्दे ना+ हैंडलिंग का कारण हो सकता है na+ में interstitium में संचय और सूजन को बढ़ावा देने. 11 , 12 हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों ने दिखाया है कि सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली दोनों की कोशिकाएं उच्च रक्तचाप की तीव्रता में योगदान देती हैं । 9 , 13 , 14 , 15 विभिन्न उच्च रक्तचाप, एंजियोटेनसिन द्वितीय, norepinephrine सहित, और नमक कारण मैक्रोफेज, monocytes और टी लिम्फोसाइटों गुर्दे और vasculature घुसपैठ और ना को बढ़ावा देने के लिए+ प्रतिधारण, वाहिकासंकीर्णन, रक्तचाप ऊंचाई और अंत अंग क्षति । 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 पहले अध्ययनों में, हमने पाया है कि dcs जमा isolevuglandin (isolg)-प्रोटीन के जवाब में अभिरुधिता एंजियोटेनसिन द्वितीय और doca-नमक उच्च रक्तचाप सहित विभिन्न हाइपरटेंसिव उत्तेजनों. 14 isolgs लिपिड peroxidation के उच्च प्रतिक्रियाशील उत्पादों रहे हैं कि तेजी से और covalently प्रोटीन पर lysines करने के लिए योगोत्पाद और उनके संचय डीसी सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ है. 14 हमने हाल ही में यह स्थापित किया है कि ऊंचा ना+ एक शक्तिशाली उद्दीपन है जो मूर्तीने डीसीएस में प्रोटीन अधिवाहिनी गठन के लिए एक प्रबल उत्तेजना है ।9 ना+ डीसीएस में प्रवेश एमिलॉराइड संवेदनशील ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है । na + तो कैल्शियम के लिए विमर्श किया जाता है (ca2 +)na के माध्यम से +/ca2 + एक्सचेंजर । Ca2 + प्रोटीन काइनेज सी (पीकेसी) को सक्रिय करता है जो नाडफ ऑक्सीडेस को बढ़ाकर सुपरऑक्साइड (ओ2·-) और आइसोग-प्रोटीन योगोत्पाद गठन के लिए अग्रणी सक्रिय करता है । नमक के 9 दत्तक स्थानांतरण-उजागर dcs primes उच्च रक्तचाप एंजियोटेनसिन द्वितीय के एक उप-pressor खुराक के जवाब में. 9
ऊतकों से CD11c+ dc की पहचान पहले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और आरटी-पीसीआर तक सीमित कर दी गई है, और डीसीएस के अलगाव को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेल सॉर्टिंग तक सीमित कर दिया गया है । हालांकि प्रवाह cytometry सेल छंटाई प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, यह महंगा है, समय लेने वाली, और व्यवहार्य कोशिकाओं की एक कम उपज की ओर जाता है । इसलिए, हम ऊतक पाचन के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम अनुकूलित किया है, विट्रो उत्तेजना में, और CD11c+ dcs के दत्तक हस्तांतरण उच्च रक्तचाप का अध्ययन करने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम CD11c+ dcs चूहों की spleens भारी से अलग करने के लिए प्रक्रियाओं को अनुकूलित किया है और adoptively नमक प्रेरित उच्च रक्तचाप में dcs की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उन्हें भोले जानवरों में स्था?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन POST290900 अनुदान द्वारा समर्थित था n.r.b., 17sdg33670829 l.x. और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों के लिए K01HL130497 मुख़र्जी
Materials
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |
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