Isolement et transfert adoptif de sel élevé traités des cellules dendritiques présentatrices d’antigène

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules dendritiques des rates murins de tri cellulaire magnétique et transfert adoptif en souris naïves de. Le modèle de cellules dendritiques activées de haut-sel a été choisi pour expliquer la procédure étape par étape de transfert adoptif et cytométrie en flux.

Abstract

La prise excessive de sel alimentaire contribue à l’inflammation et joue un rôle essentiel dans le développement de l’hypertension. Précédemment, nous avons constaté que les cellules dendritiques présentatrices d’antigènes (CD) sent élevées de sodium extracellulaire conduisant à l’activation de la NADPH oxydase et la formation d’isolevuglandin (IsoLG)-protéines adduits. Ces IsoLG-protéines adduits réagissent avec le self-protéines et promouvoir un état autoimmun-like et hypertension. Nous avons développé et optimisé state-of-the-art des méthodes pour étudier la fonction DC dans l’hypertension. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement, dans vitro traitement avec sodium élevé et transfert adoptif de murin CD11c splénique⁺ des cellules dans des souris destinataires afin d’étudier leur rôle dans l’hypertension.

Introduction

Excès de sel alimentaire est un facteur de risque majeur pour l’hypertension. ^{1 , 2} the American Heart Association recommande un maximum de 2 300 milligrammes (mg) de l’apport en sodium (Na⁺) par jour, cependant ; moins de 10 % de la population américaine observe cette recommandation. ^{3 , 4} réduction modeste apport Na⁺ abaisser la pression artérielle et réduire les nouveaux cas annuels de cardiopathies coronariennes et des accidents vasculaires cérébraux aux Etats-Unis de 20 %. ⁵ un problème majeur avec la consommation excessive de sel est que 50 % de la population hypertendue présente une sensibilité au sel, définie comme une augmentation de 10 mmHg de la tension artérielle après chargement Na⁺ ou une baisse similaire dans la tension artérielle après Na⁺ restriction et la diurèse. ⁶ sensibilité au sel également survient chez 25 % des individus normotendus et est un facteur prédictif indépendant de décès et d’accidents cardiovasculaires. ^{7 , 8} mécanismes de détection de sel dans l’hypertension impliquant le rein ont été abondamment étudiées ; Toutefois, des études récentes suggèrent que les cellules immunitaires peuvent détecter Na⁺. ^{9 , 10}

Récentes indiquent que les changements rénaux Na⁺ de manutention peuvent causer une accumulation de Na⁺ dans l’interstitium et promouvoir l’inflammation. ^{11 , 12} notre laboratoire et autres ont montré que les cellules du système immunitaire inné et adaptatif de contribuent à l’aggravation de l’hypertension. ^{9 , 13 , 14 , 15} divers stimuli hypertensifs, y compris l’angiotensine II, la norépinéphrine et sel cause macrophages, monocytes et lymphocytes T à s’infiltrer dans le rein et le système vasculaire et favorisent la rétention de Na⁺ , vasoconstriction, la pression artérielle élévation et dommages d’extrémité-organe. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} dans les études antérieures, nous avons constaté que les contrôleurs de domaine s’accumulent isolevuglandin (IsoLG)-protéines adduits en réponse à divers stimuli hypertensifs, y compris l’angiotensine II et DOCA-sel de l’hypertension. ¹⁴ IsoLGs sont des produits hautement réactives de la peroxydation lipidique qui rapidement et de façon covalente adduit de lysines des protéines et leur accumulation est associée à l’activation de DC. Formation en murin DCs.⁹ entrée Na⁺ dans DCs est médiée par l’amiloride sensible transporteurs d’adduits ¹⁴ nous avons récemment créé qu’élevée Na⁺ est un puissant stimulus pour IsoLG-protéine. Na⁺ est ensuite échangée pour le calcium (Ca^{2 +}) par l’intermédiaire de l’échangeur^{2 +} /nom de Na⁺. Ca^{2 +} active la protéine kinase C (PKC) qui active la NADPH oxydase, conduisant à une augmentation superoxyde (O₂^{· –}) et la formation d’un adduit IsoLG-protéine. ⁹ transfert adoptif de sel-exposés l’hypertension DCs nombres premiers en réponse à une dose sous presseur d’angiotensine II. ⁹

Identification des CD11c⁺ DCs de tissus a été précédemment limité à l’immunohistochimie et la RT-PCR, et isolement des contrôleurs de domaine a été limitée à la cellule tri par cytométrie en flux. Même si écoulement cytometry cellule tri est une méthode puissante pour l’isolement des cellules immunitaires, il est coûteux et fastidieux et conduit à un rendement faible de cellules viables. Par conséquent, nous avons optimisé un protocole étape par étape pour la digestion des tissus, stimulation in vitro et transfert adoptif de CD11c⁺ DCs pour étudier l’hypertension.

Protocol

De l’Université Vanderbilt animalier institutionnel et Comité d’urbanisme ont approuvé les procédures décrites dans les présentes. Souris sont logés et pris en charge conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press. Révisée en 2010). 1. isolement des rates de souris Préparer le RPMI 1640 : 10 % FBS, 0,10 mM HEPES, pyruvate de sodium 1 mM, 50 µM β-mercaptoéthanol et 1 % la pénicilline/streptomycine. <…

Representative Results

La figure 1 représente une représentation schématique des étapes décrites ci-dessus. Spleens murins isolés sont triés pour CD11c+ DCs par cellule magnétique, tri et plaqué dans les médias sels normales (NS ; 150 mmol de NaCl) ou forte media sel (HS ; 190 mmol NaCl) pendant 48 h. CD11c+ DCs moutschen acheminés par rétro-orbitaire injection pour les bénéficiaires souris naïves. Dix jours plus tard, les souris sont implant?…

Discussion

Dans le protocole actuel, nous avons optimisé les procédures pour isoler CD11c⁺ DCs des rates de souris et moutschen de transférer dans des animaux naïfs pour étudier le rôle des contrôleurs de domaine dans l’hypertension induite par le sel. Ce protocole peut être adapté pour isoler et transfert moutschen autres sous-ensembles de cellules immunitaires, dont les macrophages, les monocytes et les cellules immunitaires adaptatives dont les lymphocytes T et B. Nous avons optimisé le processus de digest…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030