眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理
Summary
眼の血管ベッドのプロテオーム解析は人間の多くの眼の病態の詳細な理解のため極めて重要です。本研究は、蛋白質の抽出と質量分析法を用いたプロテオミクス解析のモデル船としてブタの短後毛様体動脈を用いた微小血管からのサンプルの準備のため、迅速、効率的で堅牢なメソッドを示します。
Abstract
分離の眼血管高度な科学技術のアプローチを使用して眼の病態生理学的状態を解読する生体外での使用ある特定の病気の私達の理解を大きく拡げた。質量分析法 (MS)-基づくプロテオミクスの分子機構、蛋白質シグナリング経路健康および病気の血管のベッドでの変化を解明するための強力なツールとして浮上しています。ただし、MS 分析前にサンプル準備の手順が再現性のある結果と複雑なプロテオームの詳細な解明を取得する重要です。これは眼微小循環、分析に利用可能なサンプル量が多いし、したがって、最適な蛋白質の抽出のための挑戦を提起の準備のため特に重要です。この記事は、ブタの短後毛様体動脈を採用の模範的な球の眼の血管床からのサンプル準備のための効率的で高速かつ堅牢なプロトコルを提供するよう努力します。現在法清次の均質化、サンプルのペレットからのタンパク質抽出手順当ててサンプル次元ゲルの電気泳動およびペプチッドの浄化の前に、遠心ろ過デバイスのクリーニング液体クロマトグラフィー-エレクトロ スプレー イオン化線形イオン トラップ Orbitrap MS におけるラベル無料定量化のための手順。このメソッドは、眼血管のプロテオミクス解析のために特別に開発されているが説得力のある証拠、それも容易に使用できる他組織ベースのサンプルも用意いたしました。
Introduction
許可は、統合されたデータ収集力を卓越した、プロテオミクスの分野の進歩が大幅同様反射のように特定の病態の分子機構の理解に革命をもたらしました、特定の生理学的状態のセル人口や組織1,2,3,4。プロテオミクスは感度ととして最終的な診断と予後のための潜在的な疾患マーカーの同定を促進する別の眼サンプルの公平な分析により眼科研究の重要なプラットフォームであることも証明しています。証明されてエレガントな多くの研究が近年、私たちのいくつかを含む1,5,6,7,8,9,10。ただし、プロテオーム解析では特に信頼性の高い比較分析の健全な個人からの制御材料の必要性を考慮して、倫理的な理由のための人間のサンプルを得ることが困難、多くの場合。その一方で、最適かつ信頼性の高い質量分析のためのサンプルの十分な量を取得するは困難ですも。これ目のマイクロ血管など質量限定生物学的材料の特に重要です。眼血流の調節に重要な役割を果たしているようなの 1 つの主要な球血船は短後毛様体動脈 (sPCA)。緑内障と通院の前部虚血性視神経症 (NAION)11などいくつか視力を脅かす疾患の発症につながることができる深刻な臨床影響可能性があります任意摂動またはこの血管床の異常,12です。 しかし、上記の欠点のためこの動脈のベッドのプロテオーム変化の解明研究の欠如があります。そのため、近年、家豚 (イノシシイエバエ Linnaeus, 1758) として浮上している良い動物モデル眼科研究では人間とブタ13、間高い形態学的および系統学的類似点のおかげで 14,15。ブタの眼のサンプルが簡単に利用できる最も重要なことは、人間のティッシュのより正確な表現と。
これらの微小血管からの効率的な蛋白質の抽出と解析用の仕出し料理の方法論の不足と同様、目の血管の重要な役割を考慮した我々 は以前特徴付けられる社内を使用して豚の sPCA のプロテオーム解析高蛋白質16数の特定につながったプロトコル。この調査に基づき、さらに最適化して深い説明モデル組織としてブタの sPCA を用いた試料の微量からプロテオーム解析を可能にするこの記事で我々 の方法論。本研究の主な目的は、質量限定眼血管の MS 互換の方法論を確立、とはいえ実質的な実験的証拠を説明したワークフローも広くに適用できるさまざまな組織ベースのサンプルを提供しております。
このワークフローの高品質 MS 互換少量包括的プロテオーム解析のための材料の採取の準備のために尽力されると想定されます。
Protocol
ビジョン研究会と制度のガイドライン、眼科と視覚に関する研究の動物の使用は、眼科会議 (ARVO) 文を厳守で動物試料を用いた実験のすべての手順を行った。本研究は行われ、眼科医療センター Mainz の大学で承認されました。 注:視神経と眼組織のブタ目は新鮮なローカルの屠畜場から得られた事後すぐに。除核の目が冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の研?…
Representative Results
限られたサンプル可用性は、眼科研究の主な欠点の 1 つです。同様に、抽出収量の法最適なタンパク質サンプルの少量から眼の血管は議論の余地が多いよう。日には、特に球血管からの蛋白質の抽出のための仕出し料理の方法の不足があります。したがって、メソッドの最適化の最初のステップとして、一般的効果、いくつかの信頼性を比較する – 原則の証拠として?…
Discussion
包括的プロテオームの多様な眼のサンプルのプロファイリングは、分子メカニズムと健康と病気に関与するシグナル伝達経路を解明する重要かつ不可欠な最初のステップです。Mandal らによって詳細な説明のレビューで強調されるように、前のサンプルの準備の手順が欠かせない質の高いデータを取得するために、これらの解析から得られた結果の再現性を確保するため、サンプルの処理手順…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
博士 Manicam は、内部大学研究資金 (Stufe 1) ヨハネス ・ グーテンベルク大学マインツ、ドイツ研究振興協会 (MA 8006/1-1) からの助成金の大学医療センターからによってサポートされます。
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
Referências
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Citar este artigo
Perumal, N., Straßburger, L., Schmelter, C., Gericke, A., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Manicam, C. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. J. Vis. Exp. (144), e59140, doi:10.3791/59140 (2019).