눈 Microvessels의 질량 분석 기반 Proteomics 분석을 위한 시료 준비
Summary
눈 microvascular 침대의 프로테옴 특성은 인 간에 있는 많은 눈 병 리의 깊이 있는 이해를 위해. 이 연구에서는 단백질 추출 및 질량 분석 기반 proteomics 분석 모델 선박으로 돼지 짧은 후부 속눈썹 동맥을 사용 하는 작은 혈관에서 샘플 준비, 급속 한, 효과적이 고 강력한 방법 보여 줍니다.
Abstract
격리 된 눈 혈관 고급 기술 접근을 사용 하 여 눈의 병 태 생리 상태를 해독 하기 위해 생체 외에서의 사용은 크게 특정 질병의 우리의 이해 확대. 질량 분석 (MS)-기반된 단백질 분자 메커니즘 및 신호 통로 건강 및 질병에 혈관 침대에서 단백질에 있는 변경은 해명 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, MS 분석 이전 샘플 준비 단계 재현할 결과 및 복잡 한 프로테옴의 깊이 있는 설명에 결정적 이다. 이것은 눈 microvessels, 분석에 사용할 수 있는 샘플의 크기는 종종 제한 됩니다 및 따라서, 최적의 단백질 추출에 대 한 도전 포즈의 준비를 위해 특히 중요 하다. 이 문서는 모범적인 retrobulbar 안구 혈관 베드 채용 돼지 짧은 후부 속눈썹 동맥에서에서 샘플 준비에 대 한 효율적인 신속 하 고 강력한 프로토콜을 제공 하기 위해 노력. 현재 메서드 맞추고 상쾌한 균질, 다음 샘플의 펠 릿에서 단백질 추출 절차 샘플 이전 1 차원 젤 전기 이동 법 및 펩 티 드 정화 원심 필터 장치 청소 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 선형 이온 함정 Orbitrap MS 시스템에서 레이블 없는 정량화에 대 한 단계. 이 방법은 눈 microvessels의 proteomics 분석을 위해 특별히 개발 되었습니다, 하지만 우리 또한 설득력 있는 증거는 그것 또한 채택 될 수 있다 쉽게 다른 조직 기반 샘플에 대 한 제공가.
Introduction
Proteomics, 어떤 허가 통합 및 탁월한 데이터 수집 능력의 분야에서 발전 크게 반영에서 특정 질병 조건 뿐만 아니라 기본 분자 메커니즘에 대 한 우리의 이해에 혁명을는 특정 세포 인구 또는 조직1,2,,34의 생리 적인 상태입니다. Proteomics 또한 때문에 감도 및 편견된 분석으로 최종 진단 및 예 후, 잠재적인 질병 마커의 식별을 용이 하 게 다른 눈 샘플의 안과 연구에 중요 한 플랫폼으로 입증 했다 입증 우아하게 많은 연구에 의해 최근 몇 년 동안, 우리의 일부를 포함 하 여1,5,6,7,8,,910. 그러나, 그것은 종종 특히 신뢰할 수 있는 비교 분석에 대 한 건강 한 개인에서 제어 자료에 대 한 필요성을 고려 하 고 윤리적인 이유로 proteomic 분석에 대 한 인간의 샘플을 얻기 어렵다. 다른 한편으로, 그것은 또한 충분 한 양의 최적의 안정적인 대량 spectrometric 분석에 대 한 샘플을 얻기 위해 도전입니다. 이것은 눈의 혈관 마이크로 등 대량 제한 생물 재료 특히 중요 합니다. 하나 같은 주요 retrobulbar 혈관 눈 피 흐름의 규정에서 중추적인 역할을 수행 하는 짧은 후부 속눈썹 동맥 (sPCA). 어떤 섭 동 또는이 혈관 침대에 이상이 녹 내장 및 nonarteritic 이전 허 혈 성 시 신경 병 (NAION)11 등 여러 가지 광경을 위협 질병의 병 인으로 이어질 수 있는 심각한 임상 영향에 발생할 수 있습니다. , 그러나 12.,이 동맥 침대 위에서 언급 한 단점 때문에 프로테옴 변화 elucidating 연구의 부족이 있다. 따라서, 최근 몇 년 동안, 집 돼지 (Sus scrofa 부채, Linnaeus 1758)로 떠오르고 있다 좋은 동물 모델 안과 연구 인간과 돼지13, 사이 높은 형태 론 적과 계통 발생 유사성 때문에 , 1415. 돼지 눈 샘플은 쉽게 사용할 수 있으며, 가장 중요 한 것은, 인간의 조직의 더 정확한 표현.
이 microvessels에서 효율적인 단백질 추출 및 분석에 대 한 음식을 장만 하는 방법론의 부족 뿐 아니라 눈, 이러한 혈관의 중요 한 역할을 고려 하면 우리가 이전 한 사내를 사용 하 여 돼지 sPCA의 프로테옴 특징 있다 프로토콜 귀착되 었 다 단백질16의 높은 숫자의 id입니다. 이 연구를 바탕으로, 우리는 추가 최적화 고 깊이 있는 설명 모델 조직으로 돼지 sPCA를 사용 하 여 샘플의 총계에서 프로테옴 분석 수 있는이 문서에서 우리의 방법론. 이 연구의 주요 목적은 질량 제한 눈 혈관에 대 한 MS 호환 방법론을 확립 하는, 이기는 하지만 우리는 설명된 워크플로 또한 광범위 하 게에 적용할 수 있는 다양 한 조직 기반 샘플 실질적인 실험 증거 제공.
그것은이 작은 양의 종합 프로테옴 분석에 대 한 자료에서 높은-품질 MS 호환 샘플의 준비를 위한 도구가 될 것 이다 상상.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양 한 안구 샘플의 프로 파일링 종합 프로테옴 분자 메커니즘 및 신호 통로 건강 및 질병에 연루를 명료 하 게 하는 중요 하 고 필수적인 첫 번째 단계입니다. 위의 샘플 준비 단계는 강조 표시 된 검토에 의해만 달 호텔 외. 심도 있는 논의로 중요 한 고품질 데이터를 얻을 하 고 이러한 분석에서 얻은 결과의 재현성을 보장, 샘플 처리 절차 눈의 다른 부분에 대 한 2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
박사 Manicam 내부 대학 연구 자금 (Stufe 1) 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠와 도이치 가운데 (석사 8006/1-1)에서 부여의 대학 의료 센터에서 지원 됩니다.
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
Referências
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