Distribuzione dell'acqua Xylem nelle piante legnose con un microscopio elettronico a scansione crio-scansione
Summary
Osservare la distribuzione dell’acqua all’interno dello xilema fornisce informazioni significative per quanto riguarda la dinamica del flusso d’acqua nelle piante legnose. In questo studio, dimostriamo l’approccio pratico per osservare la distribuzione dell’acqua xylem in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM, che elimina i cambiamenti artifactuali nello stato dell’acqua durante la preparazione del campione.
Abstract
Un microscopio elettronico a scansione installato crio-unità (crio-SEM) consente l’osservazione dei campioni a temperature sotto zero ed è stato utilizzato per esplorare la distribuzione dell’acqua nei tessuti delle piante in combinazione con tecniche di fissazione del congelamento utilizzando azoto liquido (LN 2). Per le specie legnose, tuttavia, i preparativi per l’osservazione della superficie trasversale dello xilema comportano alcune difficoltà dovute all’orientamento delle fibre di legno. Inoltre, una maggiore tensione nella colonna d’acqua nei condotti xylem può occasionalmente causare cambiamenti artifactuali nella distribuzione dell’acqua, soprattutto durante la fissazione e la raccolta dei campioni. In questo studio, dimostriamo una procedura efficace per osservare la distribuzione dell’acqua all’interno dello xylem delle piante legnose in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM. In un primo momento, durante la raccolta del campione, misurare il potenziale dell’acqua xylem dovrebbe determinare se è presente un’alta tensione nei condotti xylem. Quando il potenziale dell’acqua xylem è basso (< ca. 0,5 MPa), è necessaria una procedura di rilassamento della tensione per facilitare una migliore conservazione dello stato dell'acqua nei condotti xylem durante la fissazione del congelamento del campione. Successivamente, un collare a tenuta stagna è attaccato intorno al gambo dell'albero e riempito con LN2 per la fissazione del congelamento dello stato dell’acqua di xylem. Dopo la raccolta, occorre fare attenzione a garantire che il campione sia conservato mentre si completano le procedure di preparazione del campione per l’osservazione. Un criostato viene impiegato per esporre chiaramente la superficie xylem taglio trasversale. Nelle osservazioni crio-SEM, è necessaria la regolazione del tempo per il congelamento per rimuovere la polvere di gelo e accentuare il bordo delle pareti cellulari sulla superficie di visualizzazione. I nostri risultati dimostrano l’applicabilità delle tecniche crio-SEM per l’osservazione della distribuzione dell’acqua all’interno di xylem a livello cellulare e subcellulare. La combinazione di crio-SEM con tecniche di osservazione in situ non distruttive migliorerà profondamente l’esplorazione delle dinamiche del flusso idrico delle piante legnose.
Introduction
La disponibilità di risorse idriche (ad esempio, precipitazioni, contenuto di acqua del suolo) determina rigorosamente la mortalità e la distribuzione geografica delle specie vegetali, poiché devono assorbire l’acqua dal suolo e trasportarla alle foglie per la produzione fotosintetica. Gli impianti devono mantenere il loro sistema di trasporto idrico sotto l’approvvigionamento idrico fluttuante. In particolare, le piante legnose generano alte tensioni nei loro condotti lungo i corsi d’acqua di traspirazione in quanto, in alcuni casi, hanno bisogno di tenere la corona a più di 100 m da terra. Per mantenere le colonne d’acqua sotto una pressione negativa così elevata, i condotti xylem consistono in un continuum di cellule tubolari con pareti cellulari rigide e lofobiche-lignifiche1. La vulnerabilità alla disfunzione xylem dei condotti xylem in ogni specie è un buon determinante della sopravvivenza delle specie sotto l’approvvigionamento idrico fluttuante2. Inoltre, lo studio dello stato dell’acqua dei condotti xylem è importante per la valutazione delle condizioni di salute dei singoli alberi sottoposti a stress abiotico o biotico. La misurazione del flusso di linfa o del potenziale idrico può fornire stime dello stato dell’acqua di un impianto legnoso a causa della funzione idraulica integrata dei condotti xylem. Inoltre, la visualizzazione della distribuzione dell’acqua nelle cellule xiliere può chiarire la condizione dei singoli componenti del sistema idraulico xylem.
Diverse tecniche per visualizzare lo stato dell’acqua dei condotti xylem esistono3. I metodi classici e utili per osservare le vie dell’acqua nel tessuto legnoso comportano la colorazione della colonna d’acqua immergendo le estremità dei rami tagliati in un colorante o iniettando un colorante nei gambi degli alberi in piedi4. La fotografia a raggi X morbida consente anche la visualizzazione della distribuzione dell’acqua dei dischi di legno a fette a causa dell’intensità differenziale di assorbimento dei raggi X dell’umidità nello xilarem5,6. Questi metodi, tuttavia, forniscono solo tracce di movimento dell’acqua o dimostrano distribuzioni macroscopiche di acqua. Recentemente, tecniche di osservazione non distruttiva, come la tomografia computerizzata a raggi X micro-fuoco (CT)7,8,9,10e la risonanza magnetica (RM)11, 12, sono stati notevolmente migliorati per consentire l’osservazione dell’acqua nei condotti xylem all’interno di alberelli intatti. Questi metodi non distruttivi hanno grandi vantaggi in quanto possiamo osservare lo stato dell’acqua dello xylem senza effetti di taglio artificiale, e possiamo monitorare le dinamiche del flusso d’acqua mediante imaging sequenziale o introducendo un agente di contrasto10. Tuttavia, dobbiamo utilizzare una risonanza magnetica personalizzata per l’imaging delle piante o un impianto specializzato per la TC a base di sincrotrone al fine di ottenere le immagini in grado di identificare il contenuto di acqua a livello cellulare. Inoltre, anche se il sistema CT basato sul sincrotrone ha permesso di ottenere immagini pregiate ad alta risoluzione spaziale, che è paragonabile alla microscopia leggera7,8,9, le cellule viventi possono essere ferite radiazione di raggi X ad alta energia13,14. L’impiego di un microscopio elettronico a scansione in cui sono installate crio-unità (crio-SEM) è un metodo molto utile per localizzare con precisione l’acqua nello xilem a livello cellulare, anche se questo richiede la raccolta distruttiva del campione per l’osservazione. Per fissare l’acqua nei condotti xylem, una parte dei gambi (ad esempio, ramoscelli, rami o steli) viene congelata in situ con azoto liquido (LN2). Le osservazioni della superficie degli esemplari rifilati e congelati da crio-SEM forniscono immagini altamente ingrandite della struttura xylem da cui possiamo identificare l’acqua nei condotti xylem come ghiaccio. Una limitazione significativa di questo metodo è che l’osservazione sequenziale della movabilità dell’acqua all’interno dello stesso campione è impossibile. Tuttavia, l’applicazione di CT o RM per l’osservazione sequenziale di alberi che vivono in un campo è estremamente impegnativa perché questi strumenti non sono portatili. Al contrario, il crio-SEM ha il potenziale per utilizzare questa tecnica su grandi alberi negli esperimenti sul campo per visualizzare chiaramente il contenuto dell’acqua non solo a livello cellulare, ma anche a un livello di struttura più fine, ad esempio acqua nei pozzi intervascolari15, acqua in spazi intercellulari16, o bolle nella colonna d’acqua17.
Molti studi che osservano l’acqua xilem da crio-SEM sono stati segnalati 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) inizialmente stabilì il protocollo per l’osservazione dello xylem in situ con gelata di un tronco vivente tramite il riempimento di LN2 in un contenitore impostato sul gambo21. La temperatura del campione è stata mantenuta al di sotto dei -20 gradi centigradi durante la raccolta del campione e durante la preparazione crio-SEM al fine di evitare lo scioglimento del ghiaccio all’interno dei condotti xylem. Questo metodo è stato utilizzato per osservare l’acqua nello xilem al fine di chiarire la distribuzione dell’acqua in condizionando il regime idrico11,12,24,25,26, 27,28, la variazione stagionale della distribuzione dell’acqua21,29,30, l’effetto dei cicli di congelamento-scongelamento17,31, 32, la distribuzione dell’acqua nel legno bagnato5, cambiamenti nella distribuzione dell’acqua durante il passaggio da sapwood a heartwood20, corso di tempo stagionale di attività cambiale e differenziazione dei vasi33, e cavitazione indotta da alcuni stress biotici23,34. Anche la conduttività idraulica e la vulnerabilità dei condotti alla cavitazione sono stati verificati utilizzando crio-SEM35,36. Cryo-SEM dotato di spettrometria a raggi X di dispersione energetica (EDX o EDS) è stato utilizzato per studiare la distribuzione degli elementi sulla superficie di un campione contenente acqua37.
Fissazione del congelamento di un tronco vivente che contiene condotti sotto alta tensione idraulica a volte provoca cavitazioni artificiali che vengono osservate dal crio-SEM come cristalli di ghiaccio fratturati nel lume dei condotti38,39. In particolare, le specie a foglia larga con condotti più lunghi e larghi sono vulnerabili a manufatti indotti dalla tensione, come la cavitazione causata dal taglio del campione, anche se condotta sott’acqua3,40. I manufatti di cavitazione diventano evidenti dopo il campionamento di un albero traspirante (cioè il campionamento durante il giorno) o in condizioni di siccità gravi e possono indurre in errore a soprastare l’occorrenza della cavitazione3,38, 39. Pertanto, la tensione di lavoro nei condotti deve essere liberata per evitare la cavitazione artifactualiva3,12,39.
La tecnica di congelazione con un coltello installato in una camera di campioni è spesso impiegata per esporre la superficie del campione per l’osservazione crio-SEM. Tuttavia, i piani congelato di tessuti vegetali legnosi, in particolare sezioni trasversali di xylem secondari, sono troppo ruvidi per osservare chiaramente le caratteristiche anatomiche e l’acqua nel tessuto6. L’applicazione di un criostato per il taglio di un campione consente una preparazione rapida e di alta qualità delle superfici campione20,23. L’obiettivo generale di questo metodo è fornire prove con la risoluzione della microscopia elettronica della distribuzione dell’acqua in vari tipi di cellule xilime in situ senza la comparsa di artefatti di campionamento. Introduciamo la nostra procedura aggiornata, che è stata costantemente migliorata da quando l’abbiamo adottata per la prima volta, per quanto riguarda il campionamento, il taglio e la pulizia della superficie del campione per ottenere micrografie elettroniche di alta qualità di campioni crio-fissi di xilema.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi di osservazione crio-SEM introdotti in questo documento sono pratici per visualizzare chiaramente la distribuzione dell’acqua su scala cellulare. Attraverso questo metodo, esplorare i cambiamenti nella distribuzione dell’acqua all’interno di xylem può potenzialmente aiutare a chiarire il meccanismo di tolleranza delle specie arboree allo stress abiotico (carenza di acqua o congelamento) o allo stress biotico (malattia degli alberi).
Il passo più importante in questo metodo è preser…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI (N. . 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
Referências
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
- Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
- Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees – Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
- Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
- Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
- Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
- Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
- Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
- Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
- Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
- Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
- McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
- Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision – A test of Scholander’s assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
- Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees – Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
- Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
- Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
- Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm?. Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
- Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
- Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
- Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
- Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
- Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
- Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
- Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees – Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
- Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
- Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species?. Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
- Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
- Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees – Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
- Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts?. Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
- Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees – Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
- Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
- Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
- Suuronen, J. -. P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).
