Xylem-Wasserverteilung in Holzpflanzen visualisiert mit einem Kryo-Scanning-Elektronenmikroskop
Summary
Die Beobachtung der Wasserverteilung innerhalb des Xylems liefert wichtige Informationen über die Wasserströmungsdynamik in holzigen Pflanzen. In dieser Studie zeigen wir den praktischen Ansatz zur Beobachtung der Xylem-Wasserverteilung vor Ort mithilfe eines Kryostats und Kryo-SEM, der artefaktische Veränderungen des Wasserstatus während der Probenvorbereitung eliminiert.
Abstract
Ein Rasterelektronenmikroskop, das Kryo-Unit (Cryo-SEM) installiert hat, ermöglicht probenbeobachtung bei Minustemperaturen und wurde zur Erforschung der Wasserverteilung in Pflanzengeweben in Kombination mit Gefrierfixierungstechniken mit flüssigem Stickstoff (LN) eingesetzt. 2). Für holzige Arten jedoch sind die Vorbereitungen zur Beobachtung der xylem quer geschnittenen Oberfläche aufgrund der Ausrichtung von Holzfasern mit einigen Schwierigkeiten verbunden. Darüber hinaus kann eine höhere Spannung in der Wassersäule in Xylem-Leitungen gelegentlich zu artefaktischen Veränderungen in der Wasserverteilung führen, insbesondere während der Probenfixierung und -entnahme. In dieser Studie zeigen wir ein effizientes Verfahren zur Beobachtung der Wasserverteilung innerhalb des Xylems von holzigen Pflanzen in situ mit Hilfe von Kryostat und Kryo-SEM. Zunächst sollte bei der Probenentnahme die Messung des Xylemwasserpotentials bestimmen, ob in den Xylem-Leitungen hochspannung vorhanden ist. Wenn das Xylem-Wasserpotential gering ist (< ca. 0,5 MPa), ist ein Spannungsentspannungsverfahren erforderlich, um eine bessere Erhaltung des Wasserzustands in Xylem-Schläuchen während der Probenfrostfixierung zu erleichtern. Als nächstes wird ein wasserdichter Kragen um den Baumstamm befestigt und mit LN2 gefüllt, um den Wasserzustand von Xylem zu fixieren. Nach der Ernte ist darauf zu achten, dass die Probe eingefroren aufbewahrt wird, während die Verfahren der Probenvorbereitung zur Beobachtung abgeschlossen sind. Ein Kryostat wird verwendet, um die xylem quer geschnittene Oberfläche deutlich zu belichten. In kryo-SEM-Beobachtungen ist eine Zeitverstellung für die Gefrierätzung erforderlich, um Froststaub zu entfernen und den Rand der Zellwände auf der Betrachtungsfläche zu akzentuieren. Unsere Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit von Kryo-SEM-Techniken zur Beobachtung der Wasserverteilung innerhalb von Xylem auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Die Kombination von Kryo-SEM mit zerstörungsfreien In-situ-Beobachtungstechniken wird die Erforschung der holzigen Pflanzenwasserströmungsdynamik grundlegend verbessern.
Introduction
Die Verfügbarkeit von Wasserressourcen (d. h. Niederschlag, Bodenwassergehalt) bestimmt streng die Sterblichkeit und geografische Verteilung der Pflanzenarten, da sie Wasser aus dem Boden aufnehmen und zur photosynthetischen Produktion zu den Blättern transportieren müssen. Die Anlagen müssen ihr Wassertransportsystem unter schwankender Wasserversorgung aufrechterhalten. Insbesondere holzige Pflanzen erzeugen hohe Spannungen in ihren Leitungen entlang der Transpirationsströme, da sie in einigen Fällen ihre Krone mehr als 100 m über dem Boden halten müssen. Um Wassersäulen unter einem derart hohen Unterdruck zu erhalten, bestehen Xylemschläuche aus einem Kontinuum von Röhrenzellen mit starren und hydrophob-lignifizierten Zellwänden1. Die Anfälligkeit für xylem Dysfunktion von Xylem-Schläuchen in jeder Art ist eine gute Determinante des Artenüberlebens unter schwankender Wasserversorgung2. Darüber hinaus ist die Untersuchung des Wasserstatus von Xylem-Schläuchen wichtig für die Beurteilung des Gesundheitszustandes einzelner Bäume, die abiotischen oder biotischen Belastungen ausgesetzt sind. Die Messung des Saftdurchflusses oder des Wasserpotenzials kann aufgrund der integrierten hydraulischen Funktion von Xylem-Leitungen Schätzungen des Wasserzustands einer holzigen Pflanze liefern. Darüber hinaus kann die Visualisierung der Wasserverteilung in Xylemzellen den Zustand einzelner Komponenten des Xylem-Hydrauliksystems klären.
Es gibt mehrere Techniken zur Visualisierung des Wasserzustands von Xylem-Leitungen3. Die klassischen und nützlichen Methoden zur Beobachtung von Wasserwegen in holzigem Gewebe beinhalten das Färben der Wassersäule, indem die Enden geschnittener Äste in einen Farbstoff eingetaucht werden oder indem ein Farbstoff in stehende Baumstämme injiziert wird4. Weiche Röntgenfotografie ermöglicht auch die Visualisierung der Wasserverteilung von geschnittenen Holzscheiben aufgrund der differenziellen Röntgenabsorptionsintensität der Feuchtigkeit in Xylem5,6. Diese Methoden liefern jedoch nur Spuren der Wasserbewegung oder zeigen makroskopische Wasserverteilungen. Kürzlich wurden zerstörungsfreie Beobachtungstechniken, wie z. B. mikrofokus-Röntgen-Computertomographie (CT)7,8,9,10und Magnetresonanztomographie (MRT)11, 12wurden deutlich verbessert, um die Beobachtung von Wasser in Xylem-Leitungen in intakten Setzlingen zu ermöglichen. Diese zerstörungsfreien Methoden haben große Vorteile, da wir den Wasserzustand des Xylems ohne künstliche Schnitteffekte beobachten können und wir die Wasserströmungsdynamik durch sequenzielle Bildgebung oder die Einführung eines Kontrastmittels10verfolgen können. Wir müssen jedoch eine kundenspezifische MRT für die Pflanzenbildgebung oder eine spezielle Einrichtung für Synchrotron-basiertes CT verwenden, um die Bilder zu erhalten, die den Zellpegelwassergehalt identifizieren können. Obwohl das Synchrotron-basierte CT-System feine Bilder mit hoher räumlicher Auflösung erhalten konnte, was mit der Lichtmikroskopie7,8,9vergleichbar ist, können lebende Zellen durch die Strahlung von hochenergetischer Röntgenstrahlung13,14. Der Einsatz eines Rasterelektronenmikroskops, in dem Kryo-Einheiten installiert sind (Cryo-SEM), ist eine sehr nützliche Methode, um das Wasser in Xylem auf zellulärer Ebene präzise zu lokalisieren, obwohl dies eine zerstörerische Entnahme der Probe zur Beobachtung erfordert. Zur Fixierung des Wassers in Xylemschläuchen wird ein Teil der Stiele (d. h. Zweige, Zweige oder Stiele) vor Ort durch flüssigen Stickstoff eingefroren (LN2). Beobachtungen der Oberfläche von getrimmten, gefrorenen Proben durch kryo-SEM liefern hochvergrößerte Bilder der Xylemstruktur, von denen aus wir das Wasser in Xylemschläuchen als Eis identifizieren können. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass eine sequenzielle Beobachtung der Wasserbeweglichkeit innerhalb derselben Probe unmöglich ist. Die Anwendung von CT oder MRT zur sequentiellen Beobachtung von Bäumen, die in einem Feld leben, ist jedoch äußerst anspruchsvoll, da diese Instrumente nicht tragbar sind. Im Gegensatz dazu hat cryo-SEM das Potenzial, diese Technik auf großen Bäumen in Feldexperimenten zu verwenden, um den Wassergehalt nicht nur auf zellulärer Ebene, sondern auch auf einer feineren Strukturebene, z.B. Wasser in intervaskulären Gruben15, Wasser in interzelluläre Leerzeichen16oder Blasen in Derwassersäule17.
Viele Studien zur Beobachtung von Xylemwasser durch kryo-SEM wurden 5 ,12,18,19,20,21,23berichtet. Utsumi et al. (1996) erstellten zunächst das Protokoll zur Beobachtung von Xylem in situ durch Einfrieren-Fixierung eines lebenden Stammes über das Befüllen von LN2 in einen Behälter, der auf den Stamm eingestellt ist21. Die Temperatur der Probe wurde während der Probenentnahme und während der Kryo-SEM-Vorbereitung unter -20 °C gehalten, um ein Schmelzen des Eises in Xylem-Leitungen zu vermeiden. Diese Methode wurde verwendet, um das Wasser in Xylem zu beobachten, um die Wasserverteilung unter wechselndem Wasserregime11,12,24,25,26zu klären. 27,28, die saisonale Variation der Wasserverteilung21,29,30, die Wirkung von Frost-Tau-Zyklen17,31, 32, die Verteilung von Wasser in nassem Holz5, Veränderungen in der Wasserverteilung während des Übergangs von Splintholz zu Kernholz20, saisonale Zeit Verlauf der cambial Aktivität und Differenzierung der Gefäße33, kavitation induziert durch bestimmte biotische Spannungen23,34. Hydraulische Leitfähigkeit und Leitungsanfälligkeit gegenüber Kavitation wurden ebenfalls mit kryo-SEM35,36überprüft. Cryo-SEM mit energiedispersiver Röntgenspektrometrie (EDX oder EDS) wurde verwendet, um die Elementverteilung über die Oberfläche einer Wasseraufnahme zu untersuchen37.
Die Frostfixierung eines lebenden Stammes, der Leitungen unter hoher hydraulischer Spannung enthält, verursacht manchmal künstliche Kavitationen, die von cryo-SEM als gebrochene Eiskristalle im Lumen der Leitungen38,39beobachtet werden. Insbesondere Breitlaubarten mit längeren und breiteren Schläuchen sind anfällig für spannungsinduzierte Artefakte, wie z. B. Kavitation durch Probenschneiden, auch wenn sie unter Wasser 3,40durchgeführt werden. Kavitationsartefakte werden nach der Probenahme eines sich aufstellenden Baumes (d. h. Probenahme während des Tages) oder unter schweren Dürrebedingungen auffällig und können zu einer Überschätzung des Kavitationsvorkommensführen 3,38, 39. Daher muss die Spannung, die in den Leitungen arbeitet, gelöst werden, um die artefaktuelle Kavitation3,12,39zu vermeiden.
Die Gefrier-Fraktur-Technik mit einem In einer Probenkammer installierten Messer wird häufig eingesetzt, um Probenoberfläche für kryo-SEM-Beobachtungen freizulegen. Gefrierfrakture Ebenen von holzigem Pflanzengewebe, insbesondere Querabschnitte von sekundärem Xylem, sind jedoch zu rau, um die anatomischen Merkmale und das Wasser im Gewebe deutlich zu beobachten6. Die Anwendung eines Kryostats zum Trimmen einer Probe ermöglicht eine schnelle und qualitativ hochwertige Aufbereitung von Probenoberflächen20,23. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, mit Elektronenmikroskopie Auflösung der Wasserverteilung in verschiedenen Arten von Xylem-Zellen in situ ohne das Auftreten von Probenahmeartefakten. Wir führen unser aktualisiertes Verfahren ein, das seit unserer einführung stetig verbessert wurde, in Bezug auf die Probenahme, das Trimmen und die Reinigung der Probenoberfläche zur Gewinnung hochwertiger Elektronenmikroskopie von kryofixierten Xylemproben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Papier eingeführten Kryo-SEM-Beobachtungsmethoden sind praktisch, um die Wasserverteilung im zellulären Maßstab klar zu visualisieren. Durch diese Methode kann die Erforschung der Veränderungen in der Verteilung von Wasser innerhalb von Xylem potenziell dazu beitragen, den Mechanismus der Toleranz von Baumarten gegenüber abiotischem Stress (Wassermangel oder Einfrieren) oder biotischem Stress (Baumkrankheit) zu klären.
Der wichtigste Schritt bei dieser Methode ist die Beibe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Nr. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
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