FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定
Summary
本研究は、フローサイトメトリー、FcγR の活性化から生じる活性酸素種 (ROS) 生産を検出するための使用方法を示します。このメソッドは、抗菌および酸化還元シグナル免疫複合体、微生物のオプソニン、または直接 FcγR 架橋への応答で食細胞の機能の変化を評価するために使用することができます。
Abstract
酸化または呼吸バーストは様々 な免疫刺激への応答の食によって酸素を急激に消費と活性酸素種 (ROS) の生成を記述する使用されます。免疫活性化中に生成された ROS は、微生物の死を引き起こす損傷 DNA とタンパク質、ROS の能力を中心に強力な抗菌活性を発揮します。再現性をもって、容易に活性酸素産生を測定することが様々 な経路やこの生体防御のメカニズムを分子の寄与を評価するために必要です。本稿では、蛍光プローブの使用方法を示すし、フローサイトメトリー活性酸素産生を検出します。広く使用されている活性酸素の蛍光測定は悪名高く問題となる、具体的でない細胞増殖刺激による活性酸素の測定に関して特に。マクロファージの生成、プライミング、染色、FcγR 架橋、およびフローサイトメトリーによる解析で終わるで始まる特定の FcγR 刺激の結果として生成された ROS を検出する詳細な方法論を提案します。
Introduction
活性酸素種 (ROS)、反応分子または (文献1) 好気性の呼吸の副産物であるフリーラジカルです。これらには、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、他の中の水酸イオンが含まれます。通常の生理学的な条件の下で ROS は主にミトコンドリアとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH) 酸化酵素によって生成され、様々 な酵素、スーパーオキシドディスムターゼやグルタチオンなどのタンパク質によって急速に無害化します。活性酸素や活性酸素を除去する能力に欠陥の誇張された生産は、酸化ストレス、活性酸素種がタンパク質、脂質、および病理学的病気の状態や死細胞ストレスにつながる DNA の損傷を促進するというで起因できます。しかし、それは現在感謝 ROS も (レドックスシグナ リング)、シグナル分子として機能し、様々 な分子および経路の中間体の活性酸素を介した変更に影響を与える細胞の代謝、増殖、生存、炎症性シグナル伝達と2を老化します。貪食細胞では、ROS は、いわゆる「呼吸バースト」1,3,4,5,6時に抗菌活性を提供する重要な役割を果たしています。外部刺激に食細胞の応答、時に NADPH オキシダーゼ複合体 (p40phox、p47phox、p67phox) のコンポーネントは gp91phox と p22phox 含む phagosomal 膜に細胞質から、若しサブユニット、Rac1/2 のアクションと共に完全に機能 NADPH オキシダーゼ酵素複合体を形成します。組み立ての NADPH オキシダーゼ、スーパーオキシド phagosomal 液胞内に酸素を減らす NADPH を利用しています。スーパーオキシドの陰イオンは、直接破損したり、過酸化水素に dismutated。スーパーオキシドと過酸化水素は、反応性の高いヒドロキシラジカルを生成する他の分子と反応できます。被害は、タンパク質の鉄硫黄クラスターとこれらの ROS の反応、dna の制限の微生物代謝または微生物5の死に最終的につながる基本の酸化を引き起こすことによって媒介されます。NADPH オキシダーゼ酵素の複合体の重要性と呼吸バースト中に生成された ROS は慢性肉芽腫症 (CGD)7,8,9,の患者で臨床的に示されて10. CGD を持つ個人は、活性酸素産生や細菌および真菌は通常免疫の個人の関心事の再発性感染症への感受性の欠如の結果 gp91phox、変異を持っています。したがって、勉強を測定することができる酸化ストレス、レドックス シグナル、または宿主防御されてかどうかリアルタイムでの活性酸素産生は有用な試みです。
複数のアッセイは、メジャーの活性酸素産生や酸化ストレス11,12,13の結果に利用されています。これらのうち、最も広く使用されるの 1 つは蛍光プローブ 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein ジアセテート (DCFH2-DA)14です。この分子は無色と脂溶性です。DCFH2– da セル膜を渡る拡散できます、細胞内エステラーゼによって速やかに DCFH2、不浸透性セルを表示にナミズムします。DCFH2 ROS (過酸化水素、ペルオキシ ナイト ライト、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、ペルオキシラジカル) の複数の種類のアクションは蛍光である DCF にそれを酸化 (Ex 報告/Em: 485-500 nm/515-530 nm)、フローを使用して検出することができますcytometer フルオレセイン (FL1 チャネル) の設定標準フィルター搭載します。スーパーオキシドは、DCFH2と強く反応しないが、製品は、蛍光 2 hydroxyethidium (同様に他の蛍光活性酸素に依存しない酸化生成物)15を生成する別のプローブ dihydroethidium (DHE) と反応することができます。518 の励起波長を用いた蛍光 dhe は酸化物を検出できる nm、発光波長 605 nm (FL2 チャネル)。身の程の知識と実験に有効があるために実行されている特定の測定手順とコントロールを染色の注意定款に ROS の検出用のプローブの使用率が必要ですを使用する比較的簡単ですが、結果と結論。次のプロトコルは、フローサイトメトリーによるロスを測定するように設計これらの 2 のプローブを用いた市販のキットの使用を示します。我々 はこれらのプローブでプライミング骨髄由来マクロファージを染色、FcγR 架橋による活性酸素産生を誘導します。このプロトコルを使用して得られた代表的なデータを提示し、成功した実験を実施する必要があります適切な予防措置を強調.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-DA ROS の dhe はベースの検出は、広く使用される手法14,15です。使いやすさと運動のマイクロ プレート フォーマットのためのこれらの ROS プローブの適応性、蛍光顕微鏡またはフロー解析は彼らの人気に貢献しています。ただし、FcγR を介したマクロファージの機能の私達の研究でそうでなかった FcγR 架橋細胞のフローサイトメトリー?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、実験室の維持およびマウス コロニーのメンテナンスにマデリン h. ミラー、オマール ・ カルドナ、Andjie Jeudy、Roopin ・ シンを含む Tigno アランフェス研究室の他のメンバーに感謝したいと思います。この研究支援グラント R00 HL122365 と J.T.T A にスタートアップ資金によって提供されました
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referências
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