Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding
Summary
Deze studie toont aan dat het gebruik van stroom cytometry te detecteren van reactieve zuurstof soorten (ROS) productie als gevolg van de activering van de FcγR. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen van veranderingen in de antimicrobiële en redox signaalfunctie van fagocyten in reactie op immuuncomplexen, opsonized micro-organismen of directe FcγR dwarsbinding.
Abstract
De oxidatieve of luchtwegen burst wordt gebruikt om te beschrijven de snelle consumptie van zuurstof en generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) door fagocyten in reactie op verschillende stimuli van immuun. ROS gegenereerd tijdens immuunactivatie oefent krachtige antibacteriële activiteit voornamelijk via het vermogen van ROS schade van DNA en eiwitten, die dood van micro-organismen veroorzaakt. Zijnde kundig voor meten van ROS productie reproducibly en met gemak is noodzakelijk teneinde de bijdrage van de verschillende trajecten en moleculen om dit mechanisme van verdediging van de gastheer. In deze paper, wij tonen het gebruik van fluorescerend sondes en stroom cytometry om te detecteren ROS productie. Hoewel het op grote schaal gebruikt, is fluorescerende meting van ROS notoir problematisch, vooral met betrekking tot de meting van ROS geïnduceerd door specifieke en niet mitogene stimuli. Presenteren we een gedetailleerde methodologie voor het detecteren van ROS gegenereerd naar aanleiding van specifieke FcγR stimulatie beginnen met macrofaag generatie, priming, kleuring, FcγR dwarsbinding en eindigend met flow cytometrische analyse.
Introduction
Reactieve zuurstof soorten (ROS) zijn reactieve moleculen of vrije radicalen die een van aërobe ademhaling bijproduct (herzien in 1). Het gaat hierbij om de superoxide anion, peroxide, waterstofperoxide, hydroxyl radicaal en hydroxyl ionen, onder anderen. In normale fysiologische omstandigheden ROS worden vooral door de mitochondriën en nicotinamide adenine dinucleotide-fosfaat (NADPH) oxidasen geproduceerd en zijn snel door verschillende enzymen en eiwitten zoals superoxide dismutase en glutathion voorkomt. Een overdreven productie van ROS of een defect in de mogelijkheid om te verwijderen van ROS kan resulteren in oxidatieve stress, waarbij reactieve zuurstof soorten bevorderen de schade van eiwitten, lipiden en DNA leidt tot cellulaire stress of dood en pathologische ziekte staten. Echter is het op dit moment gewaardeerd dat ROS ook als signalering moleculen (redox signalering fungeren kan) en ROS-gemedieerde wijziging van verschillende moleculen en traject tussenproducten cellulaire metabolisme, proliferatie, overleving, inflammatoire beïnvloeden kan signalering en veroudering van2. In fagocytische cellen speelt ROS een essentiële rol bij het verstrekken van antimicrobiële activiteit tijdens de zogenaamde “respiratoire burst”1,3,4,5,6. Tijdens de reactie van fagocyten op externe prikkels translocate onderdelen van de NADPH oxidase complexe (p40phox, p47phox, p67phox) van het cytosol aan de phagosomal membraan met de gp91phox en p22phox subeenheden, en samen met de acties van Rac1/2, vormen een volledig functionele NADPH oxidase enzym complex. De geassembleerde NADPH oxidase maakt vervolgens gebruik van NADPH ter vermindering van zuurstof tot een superoxide binnen de phagosomal vacuole. Superoxide anionen kunnen direct schade veroorzaken of worden dismutated in waterstofperoxide. Zowel superoxide en waterstofperoxide kunnen reageren met andere moleculen voor het genereren van zeer reactieve hydroxyl radicalen. Schade is bemiddeld door reactie van deze ROS met ijzer-zwavel clusters op eiwitten of door het veroorzaken van base oxidatie van DNA, uiteindelijk leidde tot beperkte microbiële metabolisme of dood van de microbe5. Het belang van het NADPH oxidase enzym complex en ROS geproduceerd tijdens de respiratoire burst wordt klinisch geïllustreerd in patiënten met chronische granulomateuze ziekte (CGD)7,8,9, 10. personen met CGD bezitten mutaties in gp91phox, wat resulteert in een gebrek aan ROS productie en gevoeligheid voor terugkerende infecties met bacteriën en schimmels die meestal niet een punt van zorg met immunocompetent individuen zijn. Daarom, of studeren oxidatieve stress, redox signalering of host defense, in staat zijn om te meten ROS productie in real time is een nuttig inspanning.
Meerdere testen hebben gebruikt maatregel ROS productie of de resultaten van oxidatieve stress11,12,13. Daaronder is een van de meest gebruikte de fluorescerende sonde 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH2-DA)14. Dit molecuul is kleurloos en lipofiele. Verspreiding van DCFH2-DA tussen de celmembranen kan hij worden opgevolgd door intracellulaire esterasen, die het deacetylates in DCFH2, waardoor zij cel ondoordringbare. De acties van meerdere soorten ROS (waterstofperoxide, peroxynitriet hydroxyl radicalen, stikstofmonoxide en peroxy radicalen) op DCFH2 het oxideren in DCF dat tl is (gerapporteerde Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) en kan worden opgespoord met behulp van een stroom cytometer uitgerust met een standaard filter instellen voor fluoresceïne (FL1 kanaal). Superoxide niet sterk reageert met DCFH2 maar met een andere sonde dihydroethidium (DHE) opbrengst van de fluorescerende product 2-hydroxyethidium (evenals andere producten van fluorescerende superoxide-onafhankelijke oxidatie)15kan reageren. De fluorescerende producten van DHE oxidatie kunnen worden opgespoord met behulp van een golflengte van de excitatie van 518 nm en een golflengte van de emissie van 605 nm (FL2 kanaal). Hoewel het relatief eenvoudig te gebruiken, vereist gebruik van deze sondes voor detectie van ROS kennis van hun beperkingen en zorgvuldige opneming van kleuring procedures en controles in de specifieke bepaling wordt uitgevoerd om geldige experimentele resultaten en conclusies. Het volgende protocol demonstreert het gebruik van een commercieel beschikbare kit deze 2 sondes voor het meten van ROS ontworpen door stroom cytometry in dienst. We primer beenmerg-afgeleide macrofagen vlek met deze sondes en veroorzaken ROS productie via het FcγR dwarsbinding. Wij presenteren representatieve gegevens verkregen met behulp van dit protocol en wijzen passende voorzorgsmaatregelen die moeten worden ondernomen voor succesvolle experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-DA- en DHE gebaseerde detectie van ROS is een veel gebruikte techniek14,15. Gebruiksgemak en het aanpassingsvermogen van deze ROS sondes voor kinetische microplate formaten, fluorescentie microscopie of stroom cytometrische analyse heeft bijgedragen tot hun populariteit. Echter in onze studies FcγR-gemedieerde macrofaag functies lijkt er niet te worden een standaardprotocol voor het uitvoeren van deze test voor flow cytometrische analyse FcγR k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank andere leden van de Tigno-Aranjuez Lab waaronder Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy en Roopin Singh voor hun hulp bij het laboratorium onderhoud en muis onderhoud van de kolonie. Steun voor dit onderzoek werd voorzien door grant R00 HL122365 en Start-up middelen naar J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referências
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
