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Ambiente

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L.

Published: February 15, 2019
doi:
10.3791/59169
, , , ,
1Southern Regional Research Center,USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology,University of Arkansas

Summary

Aquí presentamos un protocolo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en granos de maíz expresando una proteína antifúngica.  Utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus supervisamos la infección y la propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. El ensayo es rápido, fiable y reproducible.

Abstract

Contaminación por aflatoxinas en los cultivos de alimentos y piensos es un grave problema en todo el mundo. Las aflatoxinas, producidas por el hongo Aspergillus flavus (a. flavus) son potentes carcinógenos que reducen sustancialmente el valor de la cosecha de maíz y otros cultivos ricos del aceite como maní además de amenaza grave para la salud humana y animal. Diferentes enfoques, incluyendo la cría tradicional, expresión transgénica de proteínas de resistencia asociada y ARN de interferencia (ARNi)-basado en el silenciamiento génico inducido por el anfitrión del crítico a. flavus objetivos gene, están siendo evaluados para aumentar resistencia a aflatoxinas en cultivos susceptibles. Últimos estudios han demostrado un papel importante de α-amilasa en la producción de patogenesia y aflatoxina a. flavus , sugiriendo a este gen enzimático es un blanco potencial para reducir el crecimiento de a. flavus y la producción de aflatoxina. En este sentido, el actual estudio fue emprendido para evaluar expresión heteróloga (bajo control del CaMV 35S promotor constitutivo) de una proteína Lablab purpureus L. como inhibidor de la α-amilasa (IABP) en maíz contra a. flavus. IABP es una proteína de 36 KD, que es un inhibidor competitivo de la enzima α-amilasa de a. flavus y pertenece a la familia de proteínas lectin-arcelin-α-amilasa inhibidor en común haba. Estudios in vitro antes de los trabajos actuales han demostrado el papel de la IABP en la inhibición de la actividad de la α-amilasa de a. flavus y crecimiento del hongo. Crecimiento fúngico y la producción de aflatoxina en granos maduros fueron monitoreados en tiempo real utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus . Este núcleo investigación ensayo (KSA) es muy fácil de configurar y proporciona datos fiables y reproducibles en la infección y el grado de extensión que podría cuantificarse para evaluación de germoplasma y de líneas transgénicas. La fluorescencia de la cepa de la GFP es crecimiento estrechamente correlacionada a hongos y, por extensión, está bien correlacionada con valores de aflatoxina.  El objetivo del presente trabajo fue implementar este conocimiento previo en un cultivo comercialmente importante como el maíz para aumentar la resistencia de la aflatoxina. Nuestros resultados muestran una reducción del 35% – 72% en a. flavus crecimiento expresando AILP transgénicos granos de maíz que, a su vez, traducido en una reducción de 62% a 88% en los niveles de aflatoxina.

Introduction

Contaminación por micotoxinas de los géneros de hongos, Alternaria , Aspergillus, Penicilliumy Fusariumes un problema importante de los alimentos y cultivos en todo el mundo1,2,3. Entre estos hongos fitopatógenos, Aspergillus tiene el mayor impacto adverso en el valor de cultivos y salud humana y animal. Aspergillus flavus (A. flavus) es un patógeno oportunista de la planta que infecta cultivos ricos aceite tales como semilla de algodón, maíz y maní y produce el potente carcinógeno, aflatoxinas, así como numerosos metabolitos secundarios tóxicos (SMs). Maíz es un alimento importante y alimenta de cultivo en todo el mundo y es altamente susceptible a la contaminación por a. flavus. El impacto económico de la contaminación por aflatoxinas en pierde y valor reducido en el maíz puede ser tanto como $ 686,6 millones/año en los Estados Unidos2 con los cambios previstos en el clima global, el impacto de las aflatoxinas podría resultar en mayores pérdidas económicas en maíz con estimaciones tan altas como $ 1,68 billones/año en el futuro cercano2. Teniendo en cuenta los efectos adversos de la económicos y la salud de las aflatoxinas en los seres humanos y ganado, control de aflatoxinas antes de la cosecha de maíz podría ser la manera más eficiente para prevenir la contaminación por aflatoxinas en los alimentos y productos comestibles.

El enfoque de control previo a la cosecha principal de resistencia de aflatoxina en el maíz que se ha utilizado ampliamente en las últimas décadas es principalmente a través de la crianza, que requiere una cantidad significativa de tiempo4. Recientemente, el control biológico ha tenido cierto éxito en la reducción de aflatoxina en gran escala campo aplicaciones5,6. Además de biocontrol, aplicación de vanguardia herramientas moleculares como ‘Host inducida por el silenciamiento del gen”(HIGS) a través de RNAi y expresión transgénica de proteínas asociadas a resistencia ha tenido cierto éxito en la reducción del crecimiento de a. flavus y aflatoxina producción en estudios de laboratorio y de campo a pequeña escala. Estos enfoques están siendo optimizados actualmente además de identificar nuevos blancos potenciales del gene de a. flavus para la futura manipulación.

Además de genes que están directamente involucrados en la producción de micotoxinas como potenciales blancos de estrategias para el control transgénicos, amilasas fúngicas han demostrado jugar un papel crítico en mantener la producción exitosa de la patogenesia y micotoxinas durante las primeras etapas de la infección de la planta del anfitrión. Algunos ejemplos incluyen Pythium pleroticum (agente causal de la pudrición del rizoma de jengibre), Fusarium solani (agente causal de la marchitez de la coliflor), donde una correlación positiva entre la actividad y expresión de la patogenicidad y la α-amilasa se observaron 7,8. Inhibición de la actividad de la α-amilasa por golpe de gracia del gene o enfoques precipitación afecta negativamente el crecimiento fungicida, producción de toxina. Un mutante de octavos de final de la α-amilasa de a. flavus fue incapaz de producir aflatoxinas cuando se cultiva en almidón sustrato o degermed granos de maíz9. Del mismo modo, en Fusarium verticillioides una cepa de octavos de final de la α-amilasa no fumonisina B1 (micotoxinas) durante la infección de granos de maíz10. En un estudio más reciente, Gilbert et al., (2018) demostró que una basada en RNAi derribar de la expresión de α-amilasa de a. flavus a través de HIGS redujo significativamente el crecimiento y aflatoxina producción de a. flavus durante la infección del maíz núcleo11 .

Inhibidores específicos de la actividad de la α-amilasa también han producido resultados similares, obtenidos de la abajo-regulación de la expresión de α-amilasa. El primer informe sobre el papel de un inhibidor de la α-amilasa en resistencia fungicida vino desde el aislamiento y la caracterización de un inhibidor de la tripsina-α-amilasa de 14 kDa de líneas de maíz resistentes a . flavus12. Mayor proyección de varios centenares de especies de plantas por Fakhoury y Woloshuk conducido a la identificación de una proteína de tipo inhibidor de la α-amilasa 36 kDa (IABP) de las semillas de frijol Jacinto, Lablab purpureus L.13. La secuencia del péptido de lectinas de IABP se asemejó a perteneciente a la familia de lectinas – arcelin-α-amilasa inhibidor en común registrados haba14,15. IABP purificada no exhibe ninguna actividad inhibidora de tripsina mamífero y mayor caracterización in vitro demostrada una inhibición significativa del crecimiento de a. flavus y la germinación de conidios13. Los informes presentados aquí claramente muestra la α-amilasa puede servir como un destino en los enfoques de control para restringir patógenos o plagas que dependen de la movilización de la almidón (a través de la actividad de la α-amilasa) y adquisición de azúcares solubles como fuente de energía durante su interacción patógena con plantas hospederas.

Alpha-amilasa es conocida por ser crítico en a. flavus patogenicidad9,10,11y dada la importancia de la AILP como un potente anti-a. flavus agente (inhibición de la α-amilasa/antigrowth)13, hemos generado plantas de maíz transgénicas expresando Lablab AILP gene bajo el promotor CaMV 35S constitutivo. El objetivo era investigar si la expresión heteróloga de este inhibidor de la α-amilasa en maíz es eficaz contra a. flavus producción patogenia y aflatoxinas durante la infección del núcleo de maíz. Nuestros resultados demuestran que granos de maíz transgénicos expresando AILP significativamente reducción a. flavus crecimiento y aflatoxina la producción durante la infección del núcleo.

Protocol

1. construcciones plásmidos y transformación de maíz PCR amplificación Lablab AILP insertar usando los cebadores 5′-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 ‘y 5′-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3’. Las condiciones PCR incluyen un paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s (paso 1), seguido de la desnaturalización a 98 ° C durante 10 s (paso 2), recocido a 55 ° C para 30 s (paso 3), elongación a 72 ° C por 20 s (paso 4), 31 ciclos del paso 2 al paso 4 , y una elongación final a 72 ° C por …

Representative Results

Transformación de maíz y detección molecular de las plantas transgénicas Embriones inmaduros de maíz líneas Hi-II fueron transformados usando la cepa EHA101 de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de destino final planta expresando el Lablab purpureus AILP gen bajo el control del CaMV 35S promotor. Cinco líneas de maíz transformadas independientemente fuero…

Discussion

Pérdidas de rendimiento en cultivos agrícolas debido a patógenos y plagas es un problema global de20. Actualmente, la aplicación de plaguicidas y fungicidas sintéticos es el medio predominante para controlar patógenos y plagas, pero toxicidad residual de estos productos bioquímicos en los alimentos y los piensos puede representar grave amenaza para la salud humana y animal21. Teniendo en cuenta la importancia económica del maíz como alimento y cultivo de alimento, …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a David Meints, Universidad de Arkansas para su asistencia en el desarrollo y análisis de maíz transgénico durante las primeras generaciones. Este trabajo recibió el apoyo financiero del proyecto de USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. Mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura. Política de igual oportunidad de empleo (EEO) de USDA-ARS exige igualdad de oportunidades para todas las personas y prohibe la discriminación en todos los aspectos de las políticas de personal, prácticas y operaciones de la Agencia.

Materials

Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

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Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).
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