Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea
Summary
Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.
Abstract
Cochleaire binnenste haarcellen (Ihc’s) zenden akoestische signalen naar spiraalvormige ganglion neuronen (SGNs) door middel van lint synapsen. Verschillende experimentele studies hebben aangegeven dat haarcellen synapsen de initiële doelen in perceptief gehoorverlies (SNHL) kunnen zijn. Dergelijke studies hebben voorgesteld het concept van cochleaire “synaptopathie”, die verwijst naar wijzigingen in lint Synapse nummer, structuur, of functie die resulteren in abnormale synaptische transmissie tussen IHCs en SGNs. Hoewel cochlear immuunziekte onomkeerbaar is, heeft dit geen invloed op de gehoor drempel. In door lawaai geïnduceerde experimentele modellen wordt beperkte schade aan IHC synapsen in bepaalde frequentiegebieden gebruikt om de omgevingsfactoren te identificeren die specifiek synaptopathie veroorzaken, evenals de fysiologische gevolgen van het verstoren van dit binnenoor Circuit. Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van cochlear synaptische morfologie en functie in een specifiek frequentiegebied bij volwassen muizen. In dit protocol wordt cochleaire lokalisatie van specifieke frequentie regio’s uitgevoerd met behulp van plaatfrequentiekaarten in combinatie met cochleogramgegevens, waarna de morfologische kenmerken van lint synapsen worden geëvalueerd via synaptische immunokleuring. De functionele status van het lint synapsen wordt vervolgens bepaald op basis van de amplitudes van auditieve hersenstam Response (ABR) Wave I. Het voorliggende verslag toont aan dat deze aanpak kan worden gebruikt om ons begrip van de pathogenese en mechanismen van synaptische disfunctie in het cochlea te verdiepen, wat kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies.
Introduction
Frequenties in het bereik van ongeveer 20 \ u201220, 000 Hz kunnen worden waargenomen als auditieve stimuli door de mens. Het menselijk gehoor is normaalgesproken het meest gevoelig bij 1.000 Hz, waarbij het gemiddelde geluidsdrukniveau 20 μPa is bij jonge volwassenen (d.w.z. 0 decibel van het geluidsdrukniveau [dB SPL]). In sommige pathologische omstandigheden is gehoorverlies beperkt tot specifieke frequenties. Bijvoorbeeld, in de vroege stadia van lawaai-geïnduceerde gehoorverlies (NIHL), een “Inkeping” (dat wil zeggen, gehoor drempel hoogte) kan worden waargenomen in het audiogram op 4 kHz1. Langs de cochleaire partitie van zoogdieren produceren de gradaties van stijfheid en massa een exponentiële frequentie kaart, met hoogfrequente geluidsdetectie aan de basis van de slakkenhuis en lage frequentie detectie op de Apex2. Inderdaad, er is een cochleaire plaats-frequentie kaart langs het basilaire membraan, wat leidt tot wat bekend staat als tonotopische organisatie2,3. Elke gegeven plaats op het basilaire membraan heeft de hoogste gevoeligheid voor slechts één bepaalde geluidsfrequentie, die gewoonlijk de karakteristieke frequentie3,4wordt genoemd, hoewel ook reacties op andere frequenties kunnen worden waargenomen.
Tot op heden zijn verschillende Muismodellen gebruikt om de normale functie, pathologische processen en therapeutische werkzaamheid in het auditieve systeem te onderzoeken. Precieze kennis van fysiologische parameters in de muis slakkenhuis is een voorwaarde voor dergelijke studies van gehoorverlies. De muis slakkenhuis is anatomisch verdeeld in apicale, middelste en basale bochten, die corresponderen met verschillende frequentiegebieden. Door auditieve zenuw afferents te labelen in de cochlear Nucleus om hun corresponderende perifere innervatie locaties in de cochlea te analyseren, slaagde Müller et al. erin om de cochleaire plaats-frequentie kaart in de normale muis in vivo5te vestigen. In het interval van 7,2 – 61.8 kHz, dat overeenkomt met posities tussen 90% en 10% van de volledige lengte van het basilaire membraan, kan de muis cochleaire plaats-frequentie kaart worden beschreven door een eenvoudige lineaire regressiefunctie, wat duidt op een relatie tussen de genormaliseerde afstand van de cochleaire basis en de logaritme van de karakteristieke frequentie5. In laboratorium muizen kan de plaats-frequentie kaart worden gebruikt om de relatie tussen gehoor drempels binnen specifieke frequentiebereiken en cochleogrammen te onderzoeken die het aantal ontbrekende haarcellen in relatieve gebieden langs het basilaire-membraan6tonen. Belangrijk is dat de plaats-frequentie kaart een positioneringssysteem biedt voor het onderzoeken van minimale structurele schade, zoals schade aan het lint synapsen van haarcellen op specifieke cochleaire frequentie locaties in muizen met perifeer gehoor trauma7 ,8.
In de zoogdieren cochlea, lint synapsen bestaan uit een presynaptische lint, een elektron-dichte projectie die een Halo van release-Ready synaptische blaasjes met glutamaat in de IHC, en een postsynaptisch dichtheid op de zenuw terminal van de SGN met glutamaat receptoren9. Tijdens cochlear Sound transduction resulteert de afbuiging van de haarcelbundel in IHC depolarisatie, wat leidt tot het vrijgeven van glutamaat van Ihc’s op de postsynaptische afferente terminals, waardoor de auditieve route wordt geactiveerd. Activering van dit traject leidt tot de transformatie van geluidsgeïnduceerde mechanische signalen naar een tariefcode in de SGN10. Inderdaad, de IHC lint Synapse is zeer gespecialiseerd voor ondefatigable geluid transmissie bij de tarieven van honderden Hertz met hoge temporele precisie, en is van cruciaal belang voor presynaptische mechanismen van geluid coderen. Eerdere studies hebben uitgewezen dat lint synapsen sterk variëren in grootte en aantal in verschillende frequentiegebieden in de volwassen muis slakkenhuis11,12, waarschijnlijk weerspiegelen structurele aanpassing aan de specifieke geluids codering voor overlevings behoeften. Onlangs hebben experimentele dieronderzoeken aangetoond dat cochleaire synaptopathie bijdraagt aan meerdere vormen van gehoorbeschadiging, waaronder lawaai-geïnduceerde gehoorverlies, leeftijdsgebonden gehoorverlies en erfelijk gehoorverlies13, 14. zo zijn methoden voor het identificeren van gecorreleerde veranderingen in het synaptische getal, de structuur en de functie in specifieke frequentiegebieden in toenemende mate werkzaam in onderzoeken naar auditieve ontwikkeling en binnenoor ziekte, met behulp van modellen die via experimentele manipulatie van genetische of omgevingsvariabelen15,16,17.
In het huidige rapport presenteren we een protocol voor het analyseren van het synaptische getal, de structuur en de functie in een specifieke frequentie regio van het basilaire membraan bij volwassen muizen. De lokalisatie van de cochlear-frequentie wordt uitgevoerd met behulp van een bepaalde plaats-frequentie kaart in combinatie met een cochleogram. De normale morfologische kenmerken van cochleaire lint synapsen worden geëvalueerd via presynaptische en postsynaptische immunokleuring. De functionele status van cochleaire lint synapsen wordt bepaald op basis van de suprathreshold amplitudes van ABR Wave I. Met kleine wijzigingen kan dit protocol worden gebruikt om fysiologische of pathologische omstandigheden in andere diermodellen te onderzoeken, waaronder ratten, cavia’s en gerbils.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinds cochlear immuunziekte werd voor het eerst gekarakteriseerd in volwassen muizen met een tijdelijke drempel verschuiving (TTS) geïnduceerd door 8 \ u201216 kHz octaafband ruis op 100 dB SPL voor 2 h31, onderzoekers hebben steeds meer onderzocht de effecten van synaptopathie in verschillende zoogdieren, met inbegrip van apen en mensen32,33. Naast de blootstelling aan lawaai, zijn er verschillende andere voorwaarden in verband gebracht …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030); het gezamenlijke financieringsproject van de Beijing Natural Science Foundation en de Beijing education Committee (KZ201810025040); de Beijing Natural Science Foundation (7174291); en de China postdoctoral Science Foundation (2016M601067).
Materials
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 | |
Referências
- Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
- Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in “recovered” ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
- Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
- Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
- Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy–neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
- Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
- Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
- Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
- Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
- Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
- Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein’s journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
- Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
- Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).
