JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Published: May 10, 2019
doi:
10.3791/59189
, , , , , , , , ,
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University, 2Department of Otology,Shengjing Hospital of China Medical University

Summary

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Abstract

Cochlear iç saç hücreleri (ıhcs), şerit sinaps ile Spiral ganglion nöronlara (SGNs) akustik sinyalleri iletir. Çeşitli deneysel çalışmalar saç hücrelerinin sinaps sensorineval işitme kaybı (SNHL) ilk hedefler olabilir belirtti. Bu tür çalışmalar koklear “synaptopathy” kavramını önermiştir, hangi Şerit sinaps numarası, yapı veya fonksiyon değişiklikler anlamına gelir, ıhcs ve Sgns arasında anormal sinaptik iletim neden. Cochlear synaptopathy geri dönüşümsüz durumdayken işitme eşiğini etkilemez. Gürültü kaynaklı deneysel modellerde, belirli frekans bölgelerinde ıHC sinaps sınırlı hasar özellikle synaptopathy neden çevresel faktörleri belirlemek için istihdam edilir, yanı sıra bu iç kulak rahatsız edici fizyolojik sonuçları Devre. Burada, yetişkin fareler belirli bir frekans bölgesinde Cochlear sinaptik Morfoloji ve fonksiyon analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, belirli frekans bölgelerinin Cochlear lokalizasyonu, kokleogram verileriyle birlikte yer frekansı haritaları kullanılarak gerçekleştirilir, bu da şerit sinapsların morfolojik özelliklerinin sinaptik ile değerlendirildiği aşağıdaki immün boyama. Şerit sinapsların fonksiyonel durumu daha sonra işitsel beyin tepkisinin genlikleri göre belirlenir (ABR) dalga ı. Bu rapor, bu yaklaşımın, yeni terapötik müdahalelerin gelişmesine yardımcı olabilecek koklea ‘daki sinaptik disfonksiyon patogenezi ve mekanizmalarının anlayışımızı derinleştirmek için kullanılabileceğinizi göstermektedir.

Introduction

Yaklaşık aralığında Frekanslar 20 \ u201220, 000 Hz insanlar tarafından işitsel uyaranlara olarak algılanabilir. İnsan işitme normalde en 1.000 Hz, Ortalama ses basıncı düzeyi 20 μPa genç yetişkinlerde (yani, 0 desibel ses basıncı seviyesi [dB SPL]) yakın duyarlıdır. Bazı patolojik koşullarda, işitme kaybı belirli frekanslarla sınırlıdır. Örneğin, gürültü kaynaklı işitme kaybı (NIL) erken aşamalarında, bir “çentik” (yani, işitme eşik yüksekliği) 4 kHz1‘ de odyogram görülebilir. Memelinin koklear bölme boyunca, sertlik ve kütle geçişte bir üstel frekans Haritası üretir, koklea tabanında yüksek frekanslı ses algılama ve Apex2düşük frekanslı algılama. Aslında, baziler membranı boyunca koklear yer-frekans haritası vardır, tonotopik organizasyon2,3olarak bilinen ne yol. Baziler membranında verilen her yer, genellikle karakteristik frekans3,4olarak adlandırılan sadece bir özel ses frekansına en yüksek hassasiyete sahiptir, ancak diğer frekanslara tepkiler de görülebilir.

Bugüne kadar, işitsel sistemde normal fonksiyon, patolojik süreçler ve terapötik etkinliği araştırmak için çeşitli fare modelleri kullanılmıştır. Fare koklea ‘daki fizyolojik parametrelerin kesin bilgisi, işitme kaybı gibi çalışmalar için ön şarttır. Fare koklea anatomik olarak, farklı frekans bölgelerine karşılık gelen apical, orta ve bazal dönüşler ayrılmıştır. Koklea ‘daki ilgili periferik innervasyon sitelerini analiz etmek için Cochlear çekirdeğinde işitsel sinir afferentleri etiketleyerek, Müller ve al. normal fareyle saat5‘ te koklear yer-frekans haritasını kurmayı başardı. % 90 ile baziler membranın tam uzunluğunun% 10 ‘ una karşılık gelen 7.2 – 61.8 kHz aralığında, fare koklear yer-frekans Haritası basit bir doğrusal regresyon fonksiyonu ile tarif edilebilir, Koklear tabanından normalleştirilmiş mesafe ve karakteristik frekans5logaritma. Laboratuar farelerinde, yer-frekans Haritası, belirli frekans aralıkları içinde işitme eşikleri arasındaki ilişkiyi keşfetmek ve baziler membranı boyunca göreli bölgelerde eksik saç hücrelerinin sayısını gösteren kokleogramlar için kullanılabilir6. Daha da önemlisi, yer-frekans Haritası, periferik işitsel travma 7 ile farelerde belirli koklear frekans lokasyonlarında saç hücrelerinin şerit sinaps hasar gibi minimal yapısal hasar, soruşturma için bir konumlandırma sistemi sağlar ,8.

Memelide koklea ‘da, şerit sinapslar, IFC içinde glutamat içeren serbest hazır sinaptik veziküllerin bir Halo ve SGN sinir terminalinde postsinaptik yoğunluk olan bir elektron-yoğun projeksiyon olan bir presinaptik şerit oluşur. glutamat reseptörleri ile9. Koklear ses dönüştürücürü sırasında, saç hücresi paketinin sapması ıFC depolarizasyonunu elde eder, bu da ıhcs ‘den postsinaptik afferent terminallerine glutamat salınmasına yol açar ve böylece işitsel yolu aktive eder. Bu yolun aktivasyonu, ses kaynaklı mekanik sinyallerin SGN10‘ daki bir oran koduna dönüştürülmesine yol açar. Nitekim, IHC şerit sinaps yüksek temporal hassasiyet ile Hertz yüzlerce oranlarda yatıştırıcı ses iletimi için son derece uzmanlaşmıştır ve ses kodlaması presinaptik mekanizmaları için kritik öneme sahiptir. Önceki çalışmalar şerit sinaps yetişkin fare koklea11,12, büyük olasılıkla belirli ses için kodlama yapısal adaptasyon yansıtan farklı frekans bölgelerinde boyut ve sayı büyük farklılık ortaya çıktı hayatta kalma ihtiyaçları. Son zamanlarda, deneysel hayvan çalışmaları, koklear synaptopati gürültü kaynaklı işitme kaybı, yaşa bağlı işitme kaybı ve kalıtsal işitme kaybı da dahil olmak üzere birden fazla işitme bozukluğu formlarına katkı gösterdiğini göstermiştir13, 14. böylece, belirli frekans bölgelerinde sinaptik sayı, yapı ve fonksiyonlarda korelasyon değişiklikleri tanımlamak için yöntemler giderek işitsel gelişim ve iç kulak hastalığı çalışmalarında istihdam edilmiştir, aracılığıyla oluşturulan modelleri kullanarak genetik veya çevresel değişkenlerin deneysel manipülasyon15,16,17.

Mevcut raporda, Yetişkin farelerde baziler membranın belirli bir frekans bölgesinde sinaptik sayı, yapı ve fonksiyon analizi için bir protokol sunuyoruz. Koklear frekans lokalizasyonu, bir kokleogram ile birlikte belirli bir yer frekans Haritası kullanılarak gerçekleştirilir. Koklear şerit sinapsların normal morfolojik özellikleri presinaptik ve postsinaptik immünosteme yoluyla değerlendirilir. Cochlear Ribbon sinapslarının fonksiyonel durumu, ABR dalgası ı ‘nin suprathreshold amplitüllerine göre belirlenir. Küçük değişikliklerle, bu protokol, fareler, kobay ve gerbils gibi diğer hayvan modellerinde fizyolojik veya patolojik koşulları incelemek için kullanılabilir.

Protocol

Tüm prosedürler, Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı (8. baskı) için NRC/ıLAR Kılavuzu uyarınca gerçekleştirilmiştir. Çalışma protokolü, kurumsal hayvan bakımı ve sermaye Tıp Üniversitesi kullanım Komitesi, Pekin, Çin tarafından onaylandı. 1. hayvan seçimi Tüm deneyler için, Yetişkin C57BL/6J erkek fareler (8 hafta eski) hayvan modeli olarak kullanın.Not: C57BL/6J fareler Cdh23 sergi bir splice varyant taşıyan…

Representative Results

Anestezi altında 10 C57BL/6J fare (8 hafta) için ABR İşitme testleri yapıldı. ABRs 4, 8, 16, 32 ve 48 kHz ‘de ton patlaması uyarıcıları kullanılarak ortaya çıkmış. Her hayvanın işitme eşiği, ABR ‘de en az bir net dalga formunu ayırt ederek görsel olarak algılanır. Tüm fareler, uyarıcı frekansına bağlı olarak 25 ile 70 dB SPL arasında değişen ton patlamalarına yanıt olarak ABR eşiklerini sergiledi. Sonuçlarımız, işitme eşiğinin 16 kHz ‘de (Şekil 1) en…

Discussion

Cochlear synaptopathy ilk olarak, 2 saat31Için 100 dB SPL ‘de 8 \ u201216 kHz oktav Band gürültü tarafından indüklenen geçici eşik KAYMASı (TTS) ile yetişkin farelerde karakterize edildi, araştırmacılar giderek çeşitli içinde synaptopati etkilerini araştırdılar memeliler, maymunlar ve insanlar dahil32,33. Gürültü maruz kalma ek olarak, diğer bazı koşullar Cochlear synaptopathy ile ilişkili olmuştur (örneğin, ya…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81770997, 81771016, 81830030) tarafından destekleniyordu; Pekin doğal Bilim Vakfı ve Pekin Eğitim Komitesi (KZ201810025040) ortak fon projesi; Pekin doğal Bilim Vakfı (7174291); ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (2016M601067).

Materials

Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in “recovered” ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy–neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein’s journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).

Tags

CochleaFrequency RegionSynapseNeuropathyHearing LossTinnitusHyperacusisAuditory Brainstem ResponseABRCochlea DissectionParaformaldehydeEDTAMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Yu, S., Du, Z., Song, Q., Qu, T., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image