Morfologiske og funktionelle evaluering af bånd synapser på specifikke frekvensområder af musen cochlea
Summary
Dette manuskript beskriver en eksperimentel protokol til evaluering af de morfologiske egenskaber og funktionel status af bånd synapser i normale mus. Den nuværende model er også velegnet til støj-induceret og aldersrelaterede cochlear synaptopathy-begrænsede modeller. De korrelative resultater af tidligere mus undersøgelser er også drøftet.
Abstract
Cochlear indre hårceller (IHCs) sender akustiske signaler til spiral ganglion neuroner (SGNs) gennem bånd synapser. Flere eksperimentelle undersøgelser har vist, at hårcelle synapser kan være de oprindelige mål i sensorineuralt høretab (SNHL). Sådanne undersøgelser har foreslået begrebet cochlear “synaptopathy”, som refererer til ændringer i bånd synapse nummer, struktur, eller funktion, der resulterer i unormal synaptisk transmission mellem IHCs og SGNs. Mens cochlear synaptopathy er irreversibel, påvirker det ikke høretærsklen. I støj-induceret eksperimentelle modeller, begrænset skade på IHC synapser i udvalgte frekvensområder er ansat til at identificere de miljømæssige faktorer, der specifikt forårsager synaptopati, samt de fysiologiske konsekvenser af at forstyrre dette indre øre Kredsløb. Her præsenterer vi en protokol til analyse af cochlear synaptisk morfologi og funktion i en bestemt frekvens region i voksne mus. I denne protokol udføres cochlear lokalisering af specifikke frekvensområder ved hjælp af sted-frekvens kort i forbindelse med cochleogram-data, hvorefter de morfologiske egenskaber ved bånd synapser evalueres via synaptisk immun. Den funktionelle status af bånd synapser bestemmes derefter baseret på amplituder af auditive Brain EM Response (ABR) Wave I. Den foreliggende rapport viser, at denne fremgangsmåde kan bruges til at uddybe vores forståelse af patogenesen og mekanismerne i den synaptiske dysfunktion i cochlea, som kan støtte i udviklingen af nye terapeutiske interventioner.
Introduction
Frekvenser i intervallet ca. 20 \ u201220, 000 Hz kan opfattes som auditive stimuli af mennesker. Menneskelig hørelse er normalt mest følsom i nærheden af 1.000 Hz, hvor det gennemsnitlige lydtrykniveau er 20 μPa hos unge voksne (dvs. 0 decibel lydtryksniveau [dB SPL]). Under visse patologiske forhold er høretab begrænset til bestemte frekvenser. For eksempel, i de tidlige stadier af støj-induceret høretab (NIHL), en “hak” (dvs., hørelse tærskelhøjde) kan observeres i audiogram ved 4 kHz1. Langs pattedyr cochlear-partitionen producerer dens gradueringer af stivhed og masse et eksponentielt frekvens kort med højfrekvent lyddetektering ved foden af cochlea og lavfrekvens detektering ved Apex2. Faktisk er der et cochlear sted-frekvens kort langs basilær membranen, hvilket fører til, hvad der er kendt som tonotopic Organization2,3. Hvert givet sted på basilær membranen har den højeste følsomhed for kun en bestemt lydfrekvens, som normalt betegnes som den karakteristiske frekvens3,4, selv om responser på andre frekvenser også kan observeres.
Til dato, forskellige musemodeller har været ansat til at undersøge normal funktion, patologiske processer, og terapeutisk virkning i auditive system. Præcis viden om fysiologiske parametre i mus cochlea er en forudsætning for sådanne undersøgelser af høretab. Musens cochlea er anatomisk inddelt i apical, midterste og basal sving, som svarer til forskellige frekvensområder. Ved at beskrive Auditive nerve afferenter på cochlear Nucleus for at analysere deres tilsvarende perifere innervations steder i cochlea lykkedes det Müller et al. at etablere cochlear Place-frekvens kortet i den normale mus in vivo5. I intervallet 7,2 – 61.8 kHz, som svarer til positioner mellem 90% og 10% af den fulde længde af basilær membranen, kan musens cochlear-sted-frekvens kort beskrives ved en simpel lineær regressions funktion, hvilket tyder på en relation mellem normaliseret afstand fra cochlear base og logaritmen af den karakteristiske frekvens5. I laboratorie mus kan sted-frekvens kortet bruges til at udforske forholdet mellem høre tærskler inden for bestemte frekvensområder og cochleograms, der viser antallet af manglende hårceller i relative regioner langs basilær membranen6. Vigtigere er det sted-frekvens kort giver et positioneringssystem til undersøgelse af minimal strukturel skade, såsom beskadigelse af båndet synapser af hårceller på specifikke cochlear frekvens steder i mus med perifer auditiv traume7 ,8.
I pattedyrs cochlea består bånd synapserne af et præsynaptisk bånd, en elektron-tæt projektion, der gør en Halo af Release-Ready synaptiske vesikler indeholdende glutamat i IHC, og en postsynaptisk tæthed på nerve terminalen i SGN med glutamat-receptorer9. Under cochlear Sound transduction resulterer udbøjning af hårcelle bundtet i IHC depolarisering, hvilket fører til glutamat frigivelse fra IHCs på de postsynaptiske afferent terminaler, hvorved den auditive vej aktiveres. Aktivering af denne vej fører til omdannelsen af lyd-induceret mekaniske signaler til en sats kode i SGN10. Faktisk IHC Ribbon synapse er højt specialiseret til utrættelige lyd transmission på satser på hundredvis af Hertz med høj tidsmæssig præcision, og er af afgørende betydning for præsynaptiske mekanismer lydkodning. Tidligere undersøgelser har afsløret, at bånd synapser varierer meget i størrelse og antal på forskellige frekvensområder i den voksne mus cochlea11,12, sandsynligvis afspejler strukturel tilpasning til den særlige lyd kodning for overlevelses behov. Eksperimentelle dyreforsøg har for nylig vist, at cochlear synaptopathy bidrager til flere former for hørenedsættelse, herunder høretab, der er forårsaget af støj, aldersrelateret høretab og arvelig høretab13, 14. metoderne til identificering af korrelerede ændringer i det synaptiske antal, struktur og funktion på bestemte frekvensområder er således i stigende grad blevet anvendt i studier af auditiv udvikling og indre øre-sygdom ved hjælp af modeller genereret via Eksperimentel manipulation af genetiske eller miljømæssige variabler15,16,17.
I den aktuelle rapport præsenterer vi en protokol til analyse af det synaptiske tal, strukturen og funktionen i en bestemt frekvens region i basilær-membranen i voksne mus. Lokalisering af cochlear-frekvens udføres ved hjælp af et givet sted-frekvens kort i kombination med et cochleogram. De normale morfologiske egenskaber ved cochlear-bånd synapser evalueres via præsynaptisk og postsynaptisk immun farvning. Den funktionelle status for cochlear-bånd synapser bestemmes ud fra de suprathreshold-amplituder af ABR Wave I. Med mindre ændringer kan denne protokol anvendes til at undersøge fysiologiske eller patologiske tilstande i andre dyremodeller, herunder rotter, marsvin og gerbils.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da cochlear synaptopathy først blev karakteriseret i voksne mus med en midlertidig tærskel forskydning (TTS) induceret af 8 \ u201216 kHz oktavbånd støj ved 100 dB SPL for 2 h31, har forskerne i stigende grad undersøgt virkningerne af synaptopati i forskellige pattedyr, herunder aber og mennesker32,33. Ud over støjeksponering har flere andre forhold været forbundet med cochlear synaptopati (f. eks. aldring, brug af ototoksiske læge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Kinas National Natural Science Foundation (81770997, 81771016, 81830030); det fælles finansieringsprojekt i Beijing Natural Science Foundation og Beijing Education Committee (KZ201810025040); Beijing Natural Science Foundation (7174291); og China postdoc Science Foundation (2016M601067).
Materials
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 | |
Referências
- Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
- Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in “recovered” ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
- Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
- Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
- Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy–neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
- Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
- Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
- Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
- Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
- Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
- Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein’s journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
- Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
- Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).
