לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית
Summary
אנו מציגים גישות ניסיוניות של RNA-interactors לימוד של זוגיות גדילי RNA מחייב חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) במהלך מחזור התא יונקים באמצעות תאים הלה. שיטה זו משתמשת פורמלדהיד קומפלקסים crosslink RNA-PKR, immunoprecipitation להעשיר PKR מכורך RNAs. אלה RNAs ניתן לנתח נוסף דרך רצף תפוקה גבוהה או לרביעיית-PCR.
Abstract
קינאז # פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) חברה של החלבונים תגובה חיסונית מולדת, מזהה את המבנה משני גדילי כפול של RNAs ויראלי. PKR כאשר הוא מאוגד כדי כפול גדילי ויראלי RNAs (dsRNAs), עובר dimerization ו- autophosphorylation הבאים. PKR phosphorylated (pPKR) הופכת לפעילה ומשרה זירחון של יחידת משנה אלפא של חניכה האיקריוטים פקטור 2 (eIF2α) כדי לדכא את התרגום גלובלית. הגדלת הראיות עולה כי יכול להיות מופעל PKR בתנאים פיזיולוגיים כגון במהלך מחזור התא או בתנאים מתח שונים ללא זיהום. לעומת זאת, ההבנה שלנו של רנ א. תנתק של PKR מוגבל בשל חוסר שיטה ניסיונית מתוקננת לכידת וניתוח dsRNAs אינטראקציה-PKR. כאן, אנו מציגים את ניסיוני פרוטוקול במיוחד להעשיר ולנתח PKR מאוגד RNAs במהלך מחזור התא באמצעות תאים הלה. אנו מנצלים את הפעילות crosslinking יעיל של פורמלדהיד כדי לתקן את מתחמי PKR-RNA ולבודד אותם באמצעות immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs ואז יעובד נוספת כדי ליצור ספריה רצף תפוקה גבוהה. אחד כיתת אינטראקציה-PKR dsRNAs הסלולר העיקרי הוא RNAs מיטוכונדריאלי (mtRNAs), אשר יכולה להתקיים בתור dsRNAs הבין-מולקולרי כתהליכי משלימים בין סטרנד-הכבד את RNAs אור-strand. ללמוד את strandedness של אלה mtRNAs דופלקס, אנו מציגים גם עבור סטרנד ספציפיים לרביעיית-PCR פרוטוקול. פרוטוקול שלנו ממוטב עבור הניתוח של RNAs מאוגד-PKR, אך שניתן יהיה לשנותה בקלות ללמוד dsRNAs הסלולר או RNA-interactors של אחרים dsRNA מחייב חלבונים.
Introduction
קינאז # פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR), הידוע גם בשם האיקריוטים חניכה פקטור 2-אלפא קינאז 2 (EIF2AK2), היא קינאז מאופיין היטב ששולחות מידע שסופק על-ידי RNAs. זה שייך האלפא יחידה משנית חניכה 2 תרגום האיקריוטים (eIF2α) המשפחה קינאז, phosphorylates eIF2α-סרין 51 בתגובה לזיהום לדכא את תרגום כללי1. בהקשר זה, PKR מופעל על ידי נגיפי RNAs גדילי כפול (dsRNAs), המספקים פלטפורמה PKR dimerization ו autophosphorylation2. בנוסף eIF2α, PKR יכול phosphorylate גם p53, המצע קולטן לאינסולין 1, מעכב κB וקינאז c-Jun N-מסוף (JNK) להסדיר את הפעילות של רבים האות התמרה חושית מסלולים3,4,5, 6.
PKR זוהה במקור קינאז זה phosphorylated eIF2α במהלך poliovirus זיהום על ידי זיהוי של poliovirus-dsRNAs-7,–8. PKR מצוי יותר ויותר כדי לשחק תפקידים רבת מעבר התגובה החיסונית, aberrant ההפעלה או תקלה שלה היא משתמעת אינספור מחלות אנושיות. PKR מופעל/Phosphorylated (pPKR) נצפית לעתים קרובות במהלך אפופטוזיס, היא מאפיין נפוץ של חולים עם מחלות ניווניות, במיוחד מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון של, מחלת אלצהיימר9 ,10,11,12,13. בנוסף, PKR מופעלת בתנאים מתח שונים כגון מתח מטבולית, חום הלם14,15,16,17. מצד שני, עיכוב של PKR התוצאה התפשטות תאים מוגברת שינוי ממאיר אפילו18,19. PKR פונקציה חשובה גם בתפקוד מוח נורמלי, במהלך מחזור התא ככל שרמת pPKR גבוהות במהלך21,2220,שלב M. בהקשר זה, pPKR מעלימה תרגום גלובלית, מספקת רמזים כדי מערכות איתות mitotic מפתח הנדרשים עבור חלוקת התא המתאים20. יתר על כן, הפעלה ממושכת של PKR הביא בשלב G2/M מחזור התא מעצר בתוך השחלה אוגר סיני תאים23. כתוצאה מכך, זרחון PKR מוסדר על ידי הלופ משוב שלילי על מנת להבטיח שחרור משרות מהיר במהלך המעבר M/G121.
למרות הפונקציה טווח רחב של PKR, ההבנה שלנו של PKR ההפעלה מוגבלת בשל חוסר גישה ניסיוני מתוקננת של תפוקה גבוהה כדי ללכוד ולזהות dsRNAs לבצע הפעלה PKR. מחקרים קודמים הראו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם dsRNAs הנוצרת על-ידי שני הפוך Alu חזרה (IRAlus)20,24, אבל האפשרות לקיומו של dsRNAs הסלולר נוספים לבצע הפעלה PKR במהלך מחזור התא, או תחת תנאי הלחץ בתאי אדם היה שאינו גלוי. הגישה המקובלת לזיהוי RNA-interactors של RNA מחייב חלבון (RBP) משתמש אור UV עד crosslink RNA-RBP מתחמי25,26,27. מחקר שנערך לאחרונה ליישם גישה זו crosslinking UV מערכת עכבר וזיהה RNAs nucleolar קטן יכול לווסת את הפעלת PKR במהלך מתח מטבולית16. על ידי ניצול היעילות crosslinking גבוהה של פורמלדהיד, הצגנו שיטה חלופית לזהות אינטראקציה-PKR RNAs במהלך מחזור התא הלה תאים28. בגישה דומה הוחל ללמוד dsRBPs אחרים כגון Staufen ו Drosha29,30,31. מצאנו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם סוגים שונים של noncoding RNAs כגון קצר וביניהם גרעיני רכיב (סינוס), רב וביניהם רכיב גרעינית (קו), אלמנט הרטרווירוס אנדוגני (ארב) ו RNAs אפילו אלפא-לוויין. בנוסף, הראינו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם RNAs מיטוכונדריאלי (mtRNAs), אשר dsRNAs הבין-מולקולרי של טופס דרך משלימים האינטראקציה בין סטרנד-הכבד את האור לנטישה של RNAs28. פרסום האחרונות תמיכה נוספת הנתונים שלנו כי כמה mtRNAs קיים בצורה דו-צדדית, והוא יכול להפעיל dsRNA חיישנים כגון מלנומה בידול-הקשורים חלבון 5 לזירוז האינטרפרונים32. חשוב מכך, הביטוי ואת subcellular לוקליזציה של mtRNAs מאופנן במהלך מחזור התא ועל ידי לחצים שונים, אשר עשוי להיות חשוב על היכולת לווסת את הפעלת PKR28.
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט crosslinking פורמלדהיד שפותח לאחרונה, immunoprecipitation (fCLIP) שיטת לכידת וניתוח RNAs אינטראקציה-PKR במהלך מחזור התא. נדגים את השיטה כדי להכין דגימות מעצר מחזור התא באמצעות תימידין ו- nocodazole. לאחר מכן נציג את תהליך fCLIP כדי לבודד RNAs מאוגד-PKR, שיטה להכין ספריית רצף תפוקה גבוהה לזהות אלה RNAs. יתר על כן, אנו ניסחו הליכים מפורטים לנתח RNAs PKR מאוגד באמצעות לרביעיית-PCR. באופן ספציפי, אנו מציגים את הליך שעתוק במהופך סטרנד ספציפיים כדי לנתח את strandedness של mtRNAs. הפרוטוקול המתואר ממוטבת עבור הלה תאים ו- PKR, אך השלבים החשובים כגון הכנת לדוגמה מחזור התא, fCLIP, וניתוח סטרנד ספציפיים לרביעיית-PCR אפשר בקלות לשנות כדי ללמוד dsRNAs הסלולר או כדי לזהות רנ א interactors של אחרים dsRBPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
באיור1 מודגם התהליך להכין בבידוד-שלב דגימות S או M. לעצור תאים בשלב S, השתמשנו שיטה בלוק זוגי תימידין שבו התייחסנו תאים עם תימידין פעמיים עם שחרורו 9 h בין כדי להבטיח יעילות גבוהה מעצר (איור 1 א’). מעצר שלב M, התייחסנו תאים פעם אחת עם תימידין ולאחריו שחרור 9 h, ואז נמ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על-ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה משרד המדע ICT (ה-NRF-2016R1C1B2009886).
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
Referências
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
- Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
- Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
- Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
- Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
- Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
- Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection – Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
- Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
- Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer’s disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
- Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer’s disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
- Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington’s disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
- Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
- Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
- Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
- Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
- Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
- Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
- Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
- Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
- Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
- Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
- Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
- Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3′ UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
- Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
- Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).
