Atem-Sammlung von Kindern für Krankheit Entdeckung von Biomarkern
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für den Erwerb von Atemproben von Kindern. Kurz, sind Proben von Mischluft vorab in Sorptionsmittel Röhren vor der Gaschromatographie-Massenspektrometrie Analyse konzentriert. Atem-Biomarker von infektiösen und nicht infektiösen Krankheiten können mit dieser Atem Sammlung Methode identifiziert werden.
Abstract
Atem-Sammlung und Analyse können verwendet werden, um flüchtige Biomarker in einer Reihe von infektiösen und nicht infektiösen Krankheiten, wie Malaria, Tuberkulose, Lungenkrebs und Lebererkrankungen. zu entdecken Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Probenahme Atem bei Kindern und dann Stabilisierung Atemproben zur weiteren Analyse mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS). Das Ziel dieser Methode ist es, ein standardisiertes Protokoll für den Erwerb von Atemproben zur weiteren chemischen Analyse von Kindern im Alter von 4-15 Jahre zu etablieren. Erstens ist Atem Stichprobe mit einem Karton Mundstück befestigt, ein 2-Wege-Ventil, das mit einem 3 L Beutel verbunden ist. Atem Analyten sind dann eine thermische Desorption Rohr übertragen und dort gespeichert bei 4-5 ° C bis zur Analyse. Diese Technik wurde früher Atem von Kindern mit Malaria für erfolgreiche Atem Biomarker Identifikation zu erfassen. Anschließend haben wir diese Technik erfolgreich auf zusätzlichen pädiatrischen Kohorten angewendet. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es minimale Zusammenarbeit seitens des Patienten (von besonderem Wert in pädiatrischen Populationen erfordert), eine kurze Auflistung Periode hat geschultes Personal erfordert und mit tragbaren Geräten in durchgeführt werden kann begrenzten Ressourcen Feldeinstellungen.
Introduction
Biomarker können wertvolle Informationen über normale und pathologische biologische Prozesse führen, die klinisch erkennbare Krankheit beitragen kann. Vor kurzem gab es zunehmende Interesse an der Bewertung von Atem Volatiles als Biomarker für eine Vielzahl von Krankheitszuständen, einschließlich Infektionen, Stoffwechselstörungen und Krebs 1. Ausatmungsluft enthält quantifizierbare Mengen an flüchtigen organischen Verbindungen (VOC), semi-flüchtige organische Verbindungen und mikrobiell abgeleitete Material (z. B. Nukleinsäuren vor Bakterien und Viren). Das zentrale Ziel der Ausatmungsluft Analyse ist nicht-invasiv Einblick in den Status einer Erkrankung und/oder Umwelteinflüsse. Es gibt verschiedene Methoden zum sammeln und analysieren der Ausatmungsluft, abhängig von den Bestandteilen von Interesse. Derzeit gibt es keine standardisierte Ausatmungsluft Erhebungsmethode, die vergleichende Analyse der Ergebnisse in den Studien erschwert. Standardisierung der Atem Sammlung Verfahren ist wichtig, da das Stichprobenverfahren selbst einen erheblichen Einfluss auf die nachgelagerten Ergebnisse der Atem hat.
In vielen Studien ist spät Atemwege Atem Probenahme eingesetzten2,3. Diese Auswahl beinhaltet verwerfen des ersten Teils der Ausatmungsluft (“dead Space”), um bevorzugt die Luft am Ende des Kreislaufs Atem erfassen. Der Vorteil dieser Strategie ist, dass es das Niveau der exogenen VOC (z. B. ökologische VOC), minimiert während bereichernd für endogene, patientenspezifische VOC. Diese Methode verhindert Individuum vor dem Sammeln der Atemprobe, die ersten paar Sekunden ausatmen. Andere Forscher haben einen Drucksensor Probenahme in einer vordefinierten Phase Ablauf4,5aktivieren eingesetzt. Da Drucksensoren komplexe Technik erfordern, erfordert diese alternative Methode ein engagiertes und relativ kostspielig Probenahmegerät.
Pädiatrische Atem Probenahme kann besonders schwierig sein. Ein wichtiges Anliegen ist, dass junge Kinder möglicherweise nicht auf die Zusammenarbeit mit Protokolle für freiwillige Ausatmen von Luft “dead Space”. Aus diesem Grund ist es einfacher, gemischte Atemwege Atem von Kindern zu erhalten. Eine wichtige Einschränkung mit gemischten Atemwege Atemproben ist jedoch das Risiko einer Kontamination der Umwelt und Material. Deshalb ist die Machbarkeit der pädiatrischen Sammlung eine treibende Anliegen im Bereich.
Darüber hinaus, um Methoden der Datenerhebung kann Atem Probenaufbewahrung auch Sample-Qualität beeinflussen. Die hohe Luftfeuchtigkeit im Atem exhalate und der ultra-niedrigen Konzentrationen (Teile pro Billion) von flüchtigen organischen Verbindungen machen Atem Atemproben besonders anfällig für Probleme im Zusammenhang mit Speicher6,7. Trotz des großen Potenzials des Echtzeit-Techniken wie Proton Transfer Reaktion-Massenspektrometrie (PTR-MS) bleibt GC-MS der Goldstandard für die Analyse der Atemproben. Da GC-MS-Analyse der Atemproben eine offline-Technik ist, ist es mit Vorkonzentrierung Methoden wie thermische Desorption (TD) Rohre, Mikro-Festphasenextraktion und Nadel Falle Geräte gekoppelt. Bevor Sie Vorkonzentrierung müssen Atemproben in Polymer Taschen8zwischengelagert werden. Polymer-Taschen sind beliebt wegen ihrer moderaten Preis, relativ gute Haltbarkeit und Wiederverwendbarkeit. Während Taschen wiederverwendet werden können, sind Zeit und Aufwand erforderlich, um effiziente Reinigung7,8sicherzustellen. Jede spezifische Tasche verlangt auch empirisch bestimmte und standardisierte Verfahren zur Qualitätskontrolle, Wiederverwendbarkeit und Erholung.
TD-Rohre sind für Atem Vorkonzentrierung verbreitet, da sie eine große Anzahl von Volatiles erfassen und besonders angefertigt werden können. Die saugfähigen Materialien verwendet für das Verpacken von TD-Rohre können bestimmte Anwendungen und bestimmtes Ziel flüchtigen Bestandteile von Interesse angepasst. TD Rohre wesentlich verbessern den Komfort der Atem Biomarker Studien, vor allem in abgelegenen Wiese, weil TD Rohre sicher speichern Atem Volatiles für mindestens zwei Wochen und sind leicht zu Transport3.
In dem Bemühen, pädiatrische Atem Sammlung für Entdeckung von Biomarkern zu standardisieren beschreiben wir hier eine einfache Methode um Atem von Kindern zu sammeln. Um die repräsentativen Ergebnisse der implementierten Protokolle zu veranschaulichen, werden anonymisierte Daten präsentiert eine andauernde Kohorte der Kinder (8-17 Jahre) in der Bewertung für alkoholfreie Fettsäuren Leber Krankheit (NAFLD). Die vollständigen Ergebnisse und Analyse dieser Studie werden in einer späteren Publikation gemeldet. Dabei berichten wir über eine Teilmenge von Daten zur Anwendung von unserem Protokoll zu demonstrieren. In Kürze werden Kinder angewiesen, normalerweise über Mundstück Ausatmen in eine Polymer-Tasche, als ob “einen Ballon weht.” Der Prozess wird 2-4 Mal wiederholt, bis 1 L des Atems abgeholt wird. Die Probe wird dann in ein TD-Rohr übertragen und gespeichert bei 5 ° C vor der GC-MS-Analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trotz erheblicher Fortschritte in der Atem-Forschung in den letzten zehn Jahren bleiben standardisierte Verfahren für die Probenahme und Analyse von flüchtigen Stoffen Atem Gas undefiniert10. Einer der Hauptgründe für diesen Mangel an Standardisierung wurde die Vielfalt der Atem Methoden der Datenerhebung, die direkten Einfluss auf die resultierende chemische Vielfalt in jeder gegebenen Ausatmungsluft Probe haben. Atem exhalate enthält ein umfangreiches Angebot an flüchtigen organischen Verb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns für die Kinder und Familien von St. Louis Kinderkrankenhaus, die an dieser Studie teilgenommen. Wir anerkennen die einzigartige Bemühungen von Frau Stacy Postma und Frau Janet Sokolich während der Atem-Sammlung. Diese Arbeit wird von den St. Louis Children Hospital Foundation unterstützt.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
Referências
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