3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe
Summary
Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.
Abstract
Verschiedene Begrenzungen von 2D-Zellkultursystemen haben Interesse an 3D-Zellkulturen und-analyseplattformen geweckt, die die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe besser nachahmen und in vivo-Gewebefunktionen nachahmen würden. Die jüngsten Fortschritte in der Mikrofabrikationstechnologie haben die Entwicklung von 3D-Umgebungen in vitro-Umgebungen erleichtert, in denen Zellen in eine klar definierte extrazelluläre Matrix (ECM) und eine definierte Reihe löslicher oder matrix assoziierter Biomoleküle integriert werden können. Die technologischen Barrieren haben jedoch ihren weit verbreiteten Einsatz in Forschungslabors eingeschränkt. Hier beschreiben wir eine Methode, um einfache Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multizellulären Organoiden in 3D-Mikroumgebungen mit einem definierten Chemoattractant Farbverlauf zu experimentieren. Wir veranschaulichen die Nutzung dieser Plattform zur Analyse der Reaktion von Epithelzellen und Organoiden auf die Abstufungen von Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF). EGF-Steigungen waren in den Geräten für mehrere Tage stabil, was zu einer gerichteten Zweigbildung bei Brustorganoiden führte. Diese Analyse ließ zu dem Schluss kommen, dass die kollektive Gradientenwahrung durch Zellgruppen empfindlicher gegenüber einzelnen Zellen ist. Wir beschreiben auch die Herstellungsmethode, die weder Photolithografieanlagen noch fortgeschrittene Soft-Lithografie-Techniken erfordert. Diese Methode wird hilfreich sein, um 3D-zelluläre Verhaltensweisen im Zusammenhang mit der Analyse von Entwicklung und pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs, zu untersuchen.
Introduction
In physiologischer Umgebung sind Zellen in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet und einer Fülle von Biomolekülen ausgesetzt. Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Mikroumgebung regulieren intrazelluläre Prozesse, die verschiedene Phenotypen steuern, darunter Migration, Wachstum, Differenzierung und Überleben1, 2. In einer herkömmlichen 2D-Zellkultur wurde viel über zelluläre Verhaltensweisen gelernt. Mit dem Aufkommen von intravitalen Bildgebungen und Experimenten mit Zellen, die in 3D-Hydrogelen eingebettet sind, wurden jedoch wichtige Unterschiede in den Zellverhalten in den vereinfachten 2D-In-vitro-Kulturen vs. 3D-Gewebehung-ähnlichen Umgebungen erkannt. Während die Zellen mit ECM-Fasern interagieren und ihre mechanischen Eigenschaften innerhalb der 3D-Matrix spüren, ist die Materialsteifigkeit des Gels keine vollständig unabhängige Variable in einem 2D-In-vitro-System. Die Dimensionalität verändert die fokale Haftbildung, was zu einer unterschiedlichen Zellmorphologie und zum Verhalten führt. Darüber hinaus sind Zellen auf einer 2D-Oberfläche weniger Signalkassen ausgesetzt als Zellen, die in 3D für alle Richtungen offen sind.
Diese Einschränkungen haben die Interessen für 3D-Systeme erhöht, die die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe repräsentieren und besser in vivo-Gewebefunktionen vorhersagen. Sie wurden in vielen Formen entwickelt, von Organoiden als sich selbst zusammenstellende zelluläre Mikrostrukturen bis hin zu Zellen, die zufällig in ECM3,4durchsetzt sind. Die jüngsten Fortschritte in der Mikrofabrikationstechnologie haben das Aufkommen verschiedener Arten von 3D-Kultursystemen5,6,7, 8, 9 fürdie Untersuchung phänotypischer Veränderungen und Mobilartige Reaktionen auf lösliche Signale; Technische Barrieren schränken jedoch den weit verbreiteten Einsatz in Forschungslabors ein. In vielen Fällen erfordern die Herstellungsprozesse Photolithografietechniken und Hintergrundwissen für weiche Lithografie. Darüber hinaus müssen verschiedene Faktoren kontrolliert werden, um ein Gerät erfolgreich zu bauen und über einen langen Zeitraum eine optimale Funktion des Gerätes zu erreichen.
Unsere Methode beschreibt, wie man ein 3D-PDMS-Gerät konstruiert, um Zellen und multizelluläre Organoide in eine 3D-Mikroumgebung mit definierten Chemoattracten-Farbverläufen zu integrieren und dann epitheliale Reaktionen auf EGF10zu analysieren. Unsere Daten zeigen, dass die Fähigkeit von Organoiden, auf flache EGF-Steigungen zu reagieren, aus der interzellulären chemischen Kopplung durch Spaltknoten entsteht. Es schlägt das Potenzial von Organoiden für eine präzisere Erkennung von schwachen und lauten räumlich gestaffelten Eingängen vor. Der Herstellungsprozess erfordert weder eine Reinraumanlage noch Photolithografietechniken. Das 3D-PDMS-Gerät enthält jedoch notwendige Faktoren der 3D-physiologischen Umgebung. Diese Methode wird hilfreich sein, um 3D-zelluläre Verhaltensweisen zu studieren und es hat ein großes Forschungspotenzial mit verschiedenen Zelltypen, Chemoattractants und ECM-Kombinationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Herstellung von PDMS-Formen erfolgte mit einem kommerziellen 3D-Druckservice, kann aber auch mit einem High-End-3D-Drucker im eigenen Haus durchgeführt werden. Die Stereolithographie wird unter den verschiedenen 3D-Fertigungsmethoden für hochauflösende Formengenerationen empfohlen. Da die PDMS-Härtung bei einer hohen Temperatur (80 ° C) erfolgt, sollten die Materialien ausreichend thermisch beständig sein, was bei Auslagerung des Drucks explizit angegeben werden sollte. Eine thermische Nachkur kann mit dem Druc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien an AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048) und NCI U54 CA210173) und AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
Referências
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
