Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant
Summary
Descriviamo un metodo per costruire dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari. Questo dispositivo consente l’analisi delle risposte cellulari ai segnali solubili in microambienti 3D con gradienti chemioattrattante definiti. Gli organoidi sono meglio di cellule singole al rilevamento di ingressi rumorosi deboli.
Abstract
Varie limitazioni dei sistemi di coltura cellulare 2D hanno suscitato interesse per le piattaforme di analisi e coltura cellulare 3D, che simulerebbero meglio la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi e mimano le funzioni tissutali in vivo. I recenti progressi nelle tecnologie di microfabbricazione hanno facilitato lo sviluppo di ambienti 3D in vitro in cui le cellule possono essere integrate in una matrice extracellulare ben definita (ECM) e un set definito di biomolecole solubili o a matrice associata. Tuttavia, le barriere tecnologiche hanno limitato il loro uso diffuso nei laboratori di ricerca. Qui, descriviamo un metodo per costruire semplici dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari in microambienti 3D con un gradiente chemioattrattante definito. Illustreremo l’uso di questa piattaforma per l’analisi della risposta delle cellule epiteliali e degli organoidi ai gradienti dei fattori di crescita, come il fattore di crescita epidermico (FEG). I gradienti del FEG erano stabili nei dispositivi per diversi giorni, portando alla formazione di rami diretti negli organoidi del seno. Questa analisi ci ha permesso di concludere che il rilevamento del gradiente collettivo da parte di gruppi di cellule è più sensibile rispetto alle singole cellule. Descriviamo anche il metodo di fabbricazione, che non richiede strutture fotolitografiche né tecniche avanzate di Litografia morbida. Questo metodo sarà utile per studiare i comportamenti cellulari 3D nel contesto dell’analisi dello sviluppo e degli stati patologici, compreso il cancro.
Introduction
In ambiente fisiologico, le cellule sono incorporate in una matrice extracellulare (ECM) ed esposte a una pletora di biomolecole. Le interazioni tra le cellule e il microambiente circostante regolano i processi intracellulari che controllano diversi fenotipi, tra cui la migrazione, la crescita, la differenziazione e la sopravvivenza1,2. Molto è stato appreso sui comportamenti cellulari in una coltura cellulare 2D convenzionale. Tuttavia, con l’avvento dell’imaging intravitale e della sperimentazione con cellule incorporate in idrogel 3D, importanti differenze nei comportamenti delle cellule sono state riconosciute nelle colture 2D in vitro semplificate rispetto agli ambienti simili a tessuti 3D. Mentre le cellule interagiscono con le fibre ECM e percepiscono le loro proprietà meccaniche all’interno della matrice 3D, la rigidità del materiale del gel non è una variabile completamente indipendente in un sistema 2D in vitro. La dimensionalità altera la formazione di adesione focale, con conseguente morfologia e comportamento delle cellule differenti. Inoltre, le celle su una superficie 2D sono esposte a meno segnali di segnalazione rispetto alle celle aperte a tutte le direzioni in 3D.
Queste limitazioni hanno aumentato gli interessi dei sistemi 3D che rappresentano la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi e prevedono meglio le funzioni tissutali in vivo. Sono stati sviluppati in molte forme da organoidi come microstrutture cellulari auto-assemblaggio alle cellule intervallate casualmente in ECM3,4. I recenti progressi nelle tecnologie di microfabbricazione hanno facilitato l’avvento di vari tipi di sistemi di coltura 3D5, 6,7,8,9 per lo studio dei cambiamenti fenotipici e risposte cellulari ai segnali solubili; Tuttavia, le barriere tecnologiche limitano l’uso diffuso nei laboratori di ricerca. In molti casi, i processi di fabbricazione richiedono tecniche di fotolitografia e conoscenze di fondo per la litografia morbida. Inoltre, vari fattori devono essere controllati per costruire con successo un dispositivo e per ottenere una funzione ottimale del dispositivo per un lungo periodo di tempo.
Il nostro metodo descrive come costruire un dispositivo 3D PDMS per incorporare le cellule e gli organoidi multicellulari in un microambiente 3D con gradienti chemioattrattante definiti e quindi analizzare le risposte epiteliali a EGF10. I nostri dati rivelano che la capacità degli organoidi di reagire ai gradienti del FEG superficiali deriva dall’accoppiamento chimico intercellulare attraverso incroci di Gap. Suggerisce il potenziale degli organoidi per una rilevazione più precisa di ingressi deboli e rumorosi spazialmente graduati. Il processo di fabbricazione non richiede una struttura per camera bianca né tecniche di fotolitografia. Tuttavia, il dispositivo 3D PDMS include i fattori necessari dell’ambiente fisiologico 3D. Questo metodo sarà utile per studiare i comportamenti cellulari 3D e ha un grande potenziale di ricerca con diversi tipi di cellule, chemoattractants, e combinazioni ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fabbricazione di stampi PDMS è stata eseguita utilizzando un servizio di stampa 3D commerciale, ma può anche essere realizzato da una stampante 3D di fascia alta in-House. Tra i vari metodi di fabbricazione 3D, la stereolitografia è consigliata per la generazione di stampi ad alta risoluzione. Poiché la polimerizzazione PDMS si verifica ad una temperatura elevata (80 ° c), i materiali devono essere sufficientemente resistenti al termicamente, che devono essere specificati esplicitamente, se la stampa è esternali…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), e NCI U54 CA210173) e AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
Referências
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
