Endpoint importanti e marcatori proliferativi per valutare piccole lesioni intestinali e adattamento utilizzando un modello murino di mucosite indotta dalla chemioterapia

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire importanti endpoint e marcatori proliferativi di piccole lesioni intestinali e iperproliferazione compensativa utilizzando un modello di mucotisi indotta dalla chemioterapia. Dimostriamo il rilevamento di cellule che proliferano usando un marcatore specifico del ciclo cellulare e usando un piccolo peso intestinale, la profondità della cripta e l’altezza del villus come endpoint.

Abstract

L’adattamento intestinale è il meccanismo compensativo naturale che si verifica quando l’intestino viene perso a causa di un trauma. Le risposte adattive, come la proliferazione delle cellule della cripta e l’aumento dell’assorbimento dei nutrienti, sono fondamentali nel recupero, ma poco comprese. Comprendere il meccanismo molecolare alla base delle risposte adattive è fondamentale per facilitare l’identificazione di sostanze nutritive o farmaci per migliorare l’adattamento. Diversi approcci e modelli sono stati descritti in tutta la letteratura, ma è necessario un modo descrittivo dettagliato per eseguire essenzialmente le procedure per ottenere dati riproducibili. Qui, descriviamo un metodo per stimare endpoint importanti e marcatori proliferativi di piccole lesioni intestinali e iperproliferazione compensativa utilizzando un modello di mucosite indotta dalla chemioterapia nei topi. Dimostriamo il rilevamento di cellule che proliferano usando un marcatore specifico del ciclo cellulare, così come utilizzando un piccolo peso intestinale, la profondità della cripta e l’altezza del villus come endpoint. Alcuni dei passaggi critici all’interno del metodo descritto sono la rimozione e la pesatura dell’intestino tenue e il sistema software piuttosto complesso suggerito per la misurazione di questa tecnica. Questi metodi hanno i vantaggi che non richiedono molto tempo e che sono convenienti e facili da realizzare e misurare.

Introduction

L’adattamento intestinale è il meccanismo compensativo naturale che si verifica quando l’intestino viene perso a causa di malattia o chirurgia^1,2. Dopo il trauma, l’intestino subisce una risposta adattiva morfometrica e funzionale, caratterizzata da proliferazione delle cellule della cripta e aumento dell’assorbimento dei nutrienti³. Questo passaggio è fondamentale per il ripristino, ma poco compreso. Gli studi sperimentali della risposta adattiva intestinale si sono concentrati sui cambiamenti che si verificano dopo la resezione intestinale in topi, ratti e maiali, ma la comprensione del meccanismo molecolare alla base della risposta adattiva in altri tipi di lesioni (ad esempio, chimica o batterica) è fondamentale per facilitare l’identificazione di sostanze nutritive o farmaci per migliorare l’adattamento. Sperimentalmente, diversi approcci sono stati utilizzati per descrivere il complesso indice molecolare e cellulare di piccole patologie intestinali, tra cui il punteggio istopatologico e la misurazione dell’esito della lesione. Nonostante ciò, ciò che è assente dalla letteratura è una descrizione dettagliata di come eseguire le procedure necessarie per ottenere dati riproducibili. Quando si identificano i fattori coinvolti nell’adattamento, come gli ormoni intestinali, un modello animale facile, a basso costo e riproducibile è garantito e qui suggeriamo l’uso di un modello di mucosite intestinale indotta da chemioterapia (CIM).

Uno degli endpoint più semplici e molto informativi sia della lesione che dell’adattamento è misurare la massa dell’intestino tenue (SI). Sappiamo che un segno distintivo della mucosite è l’apoptosi degli enterociti, l’atrofia del villus dipendente dal tempo e la mitosi ridotta. Pertanto, l’esame della morfologia intestinale è altamente rilevante nei modelli preclinici^4,5. Nell’uomo, un declino dell’agrullllllina al plasma, un marcatore di enterociti funzionanti, correla con punteggi di tossicità e marcatori infiammatori⁶ oltre alla capacità di assorbimento⁷, suggerendo che questo aminoacido è un eccellente biomarcatore di Mucosite. L’inciglia può essere misurata sia nei topi che nei ratti, e ha mostrato eccellenti correlazioni con la lunghezza del villus⁸, la sopravvivenza della cripta⁹e la mucosite indotta da radiazioni¹⁰.

Uno dei principali vantaggi della misurazione dell’agrumile al plasma è la capacità di raccogliere misurazioni ripetute da un animale. Tuttavia, il prelievo di sangue multiplo nei topi è limitato a un volume totale di sangue di 6 l/g/settimana e richiede l’anestesia generale. Questo purtroppo limita anche l’uso delle misurazioni dell’agruminellina nei topi. Inoltre, la misurazione dell’acitrulllo richiede cromatografia liquida ad alte prestazioni^11,12, che è costosa e richiede molto tempo. Recentemente, abbiamo dimostrato che i livelli di agruminellline nei topi sono significativamente correlati al peso DI SI (p < 0,001) (dati inediti), rendendo l'agrumilluna una misurazione diretta che riflette la massa enterocitica. Una limitazione alla misurazione del peso SI è la necessità di sacrificare i topi e quindi non sono possibili misurazioni ripetute all'interno dello stesso mouse. Tuttavia, il metodo offre la possibilità di eseguire una serie di altre analisi tissutali dirette alla questione della ricerca, e questi fatti possono plausibilmente compensare l'uso aggiuntivo degli animali. Suggeriamo quindi di utilizzare il peso SI come un biomarcatore facile, a basso costo e veloce di lesioni e adattamento nei topi. Per garantire la riproducibilità e la variazione analitica accettabile, l'intestino deve essere accuratamente rimosso dall'animale, lavato con salina, svuotato e asciugato prima della pesata. In questo articolo viene illustrato esattamente come viene eseguita questa procedura.

Un altro segno distintivo della mucosite è la perdita delle cellule proliferanti nelle cripte e un’iperproliferazione compensativa durante il periodo rigenerativo³. Il marcatore cellulare Ki67 è stato spesso utilizzato per determinare le cellule proliferali veloci per mezzo di immunostachimica¹³. Anche se Ki67 è un semplice marcatore di proliferazione, ha una tendenza all’imprecisione poiché Ki67 è presente durante tutte le fasi attive del ciclo cellulare (G1, S, G2 e M)¹⁴. L’etichettatura specifica è essenziale per rilevare le cellule replicanti, motivo per cui suggeriamo l’incorporazione in situ di 5-bromo-2′-deoxyuridina (BrdU), un analogo sintetico della tiofina, in quanto è in gran parte limitato alla replica delle cellule nella fase S¹⁵. BrdU viene iniettato negli animali 150 minuti prima del sacrificio e le cellule possono essere successivamente rilevate con immunohistochimica utilizzando anticorpi specifici BrdU. In questo articolo di metodo, mostriamo esattamente come misurare l’area delle cellule immunopositive BrdU all’interno di una cripta utilizzando un software di immagine libera.

I cambiamenti morfologici e funzionali sono spesso studiati in modelli di mucosite indotta da 5-FU, dove l’adattamento intestinale viene valutato dall’altezza del villus e dalla profondità della cripta. Durante questo studio, abbiamo scoperto che durante la fase acuta della mucosite, che è uguale alla fase di lesione, la proliferazione misurata dall’incorporazione di BrdU non è correlata alla profondità della cripta. In contrasto con questo, la profondità della cripta è significativamente correlata con la proliferazione osservata nella fase di riparazione della mucosite, da 3 a 5 giorni dopo l’induzione. Ciò suggerisce che la fase acuta della mucosa non è misurabile solo per profondità della cripta. Suggeriamo che quando si utilizza la proliferazione come endpoint nella fase acuta dei topi mucositi, l’incorporazione di BrdU dovrebbe essere usata preferibilmente, ma quando si quantifica l’iperproliferazione nella fase successiva durante la fase rigenerativa, la profondità della cripta è un ragionevole alternativa all’incorporazione di BrdU. L’obiettivo di questo studio è stato quello di descrivere questo modello in modo che possa essere utilizzato da tutti i ricercatori, sia nel campo dell’oncologia, ma soprattutto i ricercatori non hanno familiarità con i modelli di lesioni intestinali.

Il modello descritto può essere utilizzato per fenotipo modelli transgenici in base alla risposta adattiva utilizzando peso corporeo, peso SI e profondità della cripta come endpoint. Ad esempio, mostriamo qui come abbiamo usato il modello di 5-fluorouracil (5-FU) indotto mucosite in un modello di knock out cellulare con insufficiente secrezione L-cell¹⁶. Peptide-1 glucagon-like (GLP-1) e peptide-2 glucagon-like (GLP-2) sono ormoni intestinali co-secreted dalle cellule L enteroendocrine in risposta all’assunzione di cibo^17,18. GLP-2 è riconosciuto come un fattore importante per la guarigione intestinale, la regolazione dell’apoptosi mucosale e il miglioramento della funzione di barriera della funzione di barriera del SI^19,20,21,22. Sulla base della letteratura, abbiamo ipotizzato che gli ormoni endogeni siano essenziali per l’iperproliferazione compensativa che si verifica nella risposta adattiva dopo l’infortunio.

Protocol

Tutti i metodi descritti sono stati condotti in conformità con gli orientamenti della legislazione danese che disciplinano la sperimentazione animale (1987). Gli studi sono stati condotti con il permesso del Danish Animal Experiments Inspectorate (2013-15-2934-00833) e del comitato etico locale. NOTA: Sono stati ottenuti topi femminili C57BL/6J (20-25 g) e alloggiati otto per gabbia in standard 12 h light, 12 h dark cycle con libero accesso all’acqua e al chow standard. Gli animali sono stati…

Representative Results

Nel primo esperimento, abbiamo indotto la mucosite nei topi al giorno 0 e sacrificato un gruppo di topi ogni giorno per 5 giorni consecutivi. Quando si misura il peso SI, abbiamo scoperto che questo parametro è diminuito dal giorno 2 fino al giorno 4 suggerendo una perdita nella massa enterocite. Abbiamo anche scoperto che al giorno 5, il peso SI non era significativamente diverso dal giorno 0 (topi non trattati) (Figura 1). La proliferazione misurata dall’i…

Discussion

Qui, dimostriamo un metodo ampiamente accessibile per studiare le lesioni e la rigenerazione delle SI in un modello murino. Esiste un’ampia varietà di modelli animali preclinici di lesioni intestinali, ma è fondamentale capire che ogni modello è unico e che gli endpoint devono essere appropriati per rispondere alla domanda di ricerca. Questo modello è eccellente per studiare la risposta adattiva alle lesioni, ma gli endpoint devono essere modificati quando si utilizza il modello come modello preclinico della mucosite…

Materials

5-Fluorouracil	Hospira Nordic AB, Sweden	137853
Ketaminol®Vet	Merck, New Jersey, USA	511485
Rompun®Vet Xylazine	Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany.	148999
10% nautral formalin buffer	Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, United Kingdom	HS-200
Pertex	HistoLab®, Sweden	840
BrdU	Sigma-Aldrich, Germany.	B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer	Thermofisher scientific, Denmark	TA-125-PM4X
Peroxide Block	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Rodent Block buffer	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody	Thermofisher Scientific, Denmark.	MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto	Thermofisher Scientific, Denmark.	TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition)	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software	LOCI, University of Wisconsin		https://imagej.nih.gov/ij/