Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi
Summary
Sıvı numunelerden ekzozomların ve hücre dışı veziküllerin etiketsiz immobilizasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile görüntülenmesi için adım adım bir prosedür tanımlanmıştır. AFM görüntüleri çözeltideki veziküllerin boyutunu tahmin etmek ve diğer biyofiziksel özellikleri karakterize etmek için kullanılır.
Abstract
Ekzozomlar ve diğer ekstrasellüler (EVs) lipid membran vezikül, membran proteinleri ve diğer moleküller tarafından yüzey dekorasyonu ve rna içeren bir ana hücreden miras farklı luminal içeriği oluşan moleküler kompleksleri, proteinler ve DNA’lar. Vezikülboyutuna ve yüzey süslemelerinden oluşan koronal tabakasının büyüklüğüne bağlı olarak EV’lerin hidrodinamik boyutlarının karakterizasyonu rutin hale gelmiştir. Exozomlar için, EVs en küçük, hidrodinamik ve vezikülboyutları arasındaki göreli fark önemlidir. Vezikül boyutlarının kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme siperasyonu, altın standart bir teknik olan, cihazın maliyeti, numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi ve sık sık görüntülerde gözlenen parçacıkların az sayıda. Yaygın olarak kullanılabilir ve erişilebilir bir alternatif atomik kuvvet mikroskobu (AFM), üç boyutlu geometri, boyut ve ekstrahücre içi veziküllerin diğer biyofiziksel özellikleri hakkında çok yönlü veri üretebilir. Geliştirilen protokol, bu analitik aracı kullanırken kullanıcılara rehberlik eder ve AFM tarafından EVs analizi için iş akışını özetler, bu da sulu veya kurutulmuş formdaki görüntüleme E’leri için numune hazırlamasını içerir, elektrostatik immobilizasyon bir substrat, veri toplama, analizi ve yorumlanması üzerine veziküller. Temsili sonuçlar, modifiye mika yüzeyindeki EV fiksasyonunun öngörülebilir, özelleştirilebilir olduğunu ve kullanıcının çok sayıda vezikül için boyutlandırma sonuçları elde etmesini sağladığını göstermektedir. AFM verilerine dayalı vezikül boyutlandırmasının kriyo-TEM görüntüleme ile uyumlu olduğu bulunmuştur.
Introduction
Ekstrasellüler veziküller (EVs) kan, idrar, tükürük, süt ve amniyotik sıvı da dahil olmak üzere tüm vücut sıvıları mevcuttur. Ekzozomlar, endozomal biyogenez, endozomal yolun belirteçleri ve tüm EV’ler arasında en küçük boyut ile diğer EV’lerden farklılaşan bir bölge sınıfı oluştururlar. Ekzozomların büyüklüğü genellikle çalışmalar arasında önemli bir değişkenlik ile bildirilmiştir. Boyutlandırma sonuçlarının yönteme bağımlı olduğu, ev boyutlarını tahmin etmek için farklı analitik tekniklerle kullanılan fiziksel ilkeler arasındaki farkı yansıttığı bulunmuştur1,2. Örneğin, nanopartikül izleme analizi (NTA) ― en yaygın olarak kullanılan boyut karakterizasyon tekniği ― evs’lerin boyutunu, çözeltideki EV’lerin Brownian hareketliliğine karşı direnci karakterize eden hidrodinamik çapları olarak tahmin eder. Bir vezikül daha büyük bir hidrodinamik çapı sıvı düşük hareketlilik anlamına gelir. Veziküllerin etrafındaki koronal tabaka, membran yüzeyine demirlemiş veya adsorbe edilmiş yüzey proteinlerinden ve diğer moleküllerden oluşan, hareketliliği önemli ölçüde engeller ve EVs’lerin hidrodinamik boyutunu artırır. Göreceli olarak, bu artış özellikle ekzozomlar için büyüktür 3, Şekil 1’degösterildiği gibi .
Kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme, sulu hallerinde vezikül boyutları ve morfolojisini karakterize etmede belirleyici bir tekniktir. Ancak, enstrümantasyon yüksek maliyet ve doğru sulu EVs görüntü alternatif tekniklerin keşfi motive kullanmak için gerekli özel uzmanlık. Edinilmiş kriyo-TEM görüntülerinde gözlenen veya karakterize edilen nispeten az sayıda EV bu tekniğin bir diğer önemli dezavantajıdır.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yüzeydeki parçacıkların görüntüsünü canlandırmak için substrat boyunca bir sonda tarayarak sulu veya kurutulmuş EVs4,5,6 üç boyutlu topografya görselleştirir. EVs’i AFM ile karakterize etmek için protokolün temel adımları bu çalışmada özetlenmiştir. Sıvı vezikülleri görüntülemeden önce, bir substrat üzerinde ya işlevsel bir yüzeye tethering tarafından immobilize edilmelidir, bir filtre içinde bindirme, ya da elektrostatik çekim7. Pozitif yüklü bir substrat üzerindeki elektrostatik fiksasyon, negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların immobilizasyonu için özellikle uygun bir seçenektir. Ancak, yüzeydeki hücre dışı vezikülleri hareketsiz hale getiren aynı elektrostatik kuvvetler de şekillerini bozar, bu da post-görüntüleme veri analizini gerekli kılar. Bu noktayı, yüzeyde hareketsiz hale getirilen ekzozomların çarpık şekli ne kadar çarpık şekli ne kadar aparat lara dayanarak çözümdeki küresel veziküllerin boyutunu tahmin eden algoritmayı tanımlayarak ayrıntılı olarak ele alıyoruz.
Geliştirilen protokolde, veziküllerin sağlam elektrostatik immobilizasyonu için prosedür sunulur ve sulu veya kurutulmuş durumlarda atomik kuvvet görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli adımları takip eder. Hareketsiz veziküllerin yüzey konsantrasyonunu etkileyen faktörler tanımlanır. Çözeltide farklı yoğunlukta EV’lere sahip numuneler için elektrostatik immobilizasyonun nasıl gerçekleştirilenekadar gerçekleştirildiği konusunda kılavuz verilir. Yeterince çok sayıda hareketsiz veziküle dayalı farklı biyofiziksel özelliklerin ampirik olasılık dağılımlarının tahmin edilmesine izin veren deneysel koşulların seçimi tartışılmıştır. AFM verilerinin post-görüntüleme analiziörnekleri verilmiştir. Özellikle, immobilize EVs AFM karakterizasyonu dayalı çözüm veziküllerin boyutunu belirlemek için bir algoritma açıklanmıştır. Temsili sonuçlar, AFM tarafından kriyo-TEM görüntüleme sonuçları ile vezikül boyutlandırmasının tutarlılığını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
EVs’nin biyolojik bir sıvıdan immobilizasyonu, yüzey taraması ve görüntü analizi, sıvı daki EV’lerin AFM karakterizasyonu için geliştirilen protokolün temel adımlarıdır. Görüntülenmiş yüzey alanı ve substrat üzerinde immobilize veziküllerin yüzey konsantrasyonu ile AFM görüntüleme ölçekler için uygun veziküllerin sayısı. EVs ve ekzozomlar18negatif zeta potansiyeli göz önüne alındığında, biz AFM substrat sıvı numunelerden EVs elektrostatik fiksasyon savunuc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Ulusal Bilim Vakfı (ödül numarası IGERT-0903715), Utah Üniversitesi (Kimya Mühendisliği Tohum Hibe ve Lisansüstü Araştırma Bursu Ödülü Bölümü) ve Skolkovo Bilim Enstitüsü mali destek kabul ve Teknoloji (Skoltech Bursu).
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
Referências
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
