電気泳動によるγ-アミノ酪酸 (GABA) のてんかん焦点への送達は、マウスでの発作を防ぐ
Summary
てんかん研究の課題は、古典療法が不十分な患者のための新しい治療法を開発することです。新しいプロトコルを使用して-移植可能な薬物送達システムの助けを借りて、我々は、てんかんの焦点に GABA の電気泳動配信によって麻酔をかけられたマウスの発作を制御することができます。
Abstract
てんかんは、世界中の何百万人もの人々に影響を与える神経疾患のグループです。薬による治療は 70% の症例で有用であるが、重篤な副作用は患者の生活の質に影響を与える。さらに, てんかん患者の高い割合は、薬剤耐性であります;彼らの場合、脳神経外科または神経刺激が必要です。したがって、てんかん研究の主な目的は、副作用のないてんかんを治療するか、薬剤耐性患者における再発発作を予防することができるいずれかの新しい治療法を発見することです。Neuroengineering は、新たな戦略と技術を使用して、リスクのあるてんかん患者を治療するためのより良いソリューションを見つけることによって、新しいアプローチを提供します。
てんかんの急性マウスモデルにおける新規な実験的プロトコルの実証として、直接現場での電気泳動薬物送達システムが用いられている。すなわち、局所的な神経活動のオンデマンドの薬物送達と同時記録のためにマイクロ流体イオンポンプ (μFIP) を組み込んだ神経プローブを移植し、4-アミノピリジン誘発性 (4AP 誘発) の発作様を制御できることを実証した。イベント (SLE) のアクティビティ。Γ-アミノ酪酸 (GABA) 濃度は、発作の焦点で抗てんかん効果に到達するが、overinhibition 誘発リバウンドバーストを引き起こさない GABA 送達の正確な制御によって生理的範囲に保持されます。この方法は、病理学的活性および介入の両方を検出し、正確な時空制御を用いて阻害性神経伝達物質をてんかん焦点に直接送達することによって発作を停止させる。
実験方法への開発の結果として、SLEs は、発作発症時に正確に調整された GABA 送達による発作制御を可能にする高度に局在化した方法で誘導することができる。
Introduction
てんかんは、第4の最も一般的な神経障害である: 人口の約 1% がてんかんに罹患し、そして約3分の1の罹患者が再発発作を有する。ほとんどの場合、発作は投薬で制御することができます。しかし、薬物治療は個々に患者ごとに設定する必要があり、適切な投薬には1,2を見つけるのに何年もかかることがあります。さらに, 薬のほとんどは、生活の質を低下させる重篤な副作用を持っています3,4,5,6,7.最後に、症例の 30% において、患者は投薬に耐性であり、かつ一定の単一発作発生器遺伝子座の場合には、resective 脳神経外科のみが発作8の発生を減弱させることができる。したがって、現代のてんかん研究における主要なイニシアチブは、強力な薬物療法および侵襲的 resective 手術の必要性を低減しつつ、リスクのある患者の再発発作を防ぐことができる新しい戦略を発見することである。
脳全体 (全身性てんかん) または脳の局在化した部分 (集中型てんかん) の興奮性および阻害回路内で不均衡がある場合に、神経細胞が異常な方法で排出するようなてんかん発作が発生する9,10,11.抗てんかん薬は、発作予防において2つの異なる方法で作用することができる: 刺激を減少させるか、または阻害を増強する12.具体的には、それらは、細胞膜13におけるイオンチャネルに影響を与えることによって神経細胞の電気的活性を改変するか、または抑制性神経伝達物質 GABA または興奮性に影響を及ぼすニューロン間の化学伝達に作用することができるシナプスにおけるグルタミン酸14,15.いくつかの薬について, 行動様式は不明です18.また、薬物治療は患者に継続的な影響を及ぼし、発作の罹患率ダイナミクスに適応することはできません。理想的には、特定の作用機序を有する薬物が、根底にあるてんかんプロセスに作用するであろう。最適な治療は、脳の interictally には触れませんが、発作が発症し始めるとすぐに作用します。それとは対照的に、てんかんのすべての場合において、投薬は、現在、全身の脳および患者9の全身に影響を及ぼす系統的な治療を意味する。
てんかん発作は、脳外傷などの初期の侮辱の後に何年も現れることがあります。初期の侮辱と最初の自発的な発作の発生の間の期間は、ニューロンのネットワーク接続および軸索の消滅によるニューロン死を含む、かなりの分子および細胞の再編成によって特徴付けられる萌芽/neosynaptogenesis 新しい接続の外観19,20,21.発作が再発すると、その頻度と重症度が増加する傾向があり、より多くの脳領域が関与する。発作起源および伝播の規則が異なる場合があるので、伝播ネットワークからの発作発症 (epileptogenic 領域) の部位を区別することが重要である。ヒト組織およびてんかんの実験モデルに対して行われた研究は、回路の再編成および発作を発生させる能力に関する重要なデータを提供している20、21、22、 23. しかし、これらの再編成が適応応答であるか、または epileptogenesis または因果に関連しているかどうかを判断することは困難である。
したがって、てんかんの焦点をローカライズし、抗てんかん薬を局所的に適用することは、現代のてんかん研究における主な課題の1つです。てんかんおよびいくつかの臨床研究の動物モデルを用いたいくつかの実験は、発作事象の発症を見つけ、脳24、25、26、27における根本的なメカニズムを定義することを目的とした。この目的のために、我々は、急性マウス調製において4AP 誘発てんかんモデル28、29、30、31を用いて新しい実験プロトコールを開発し、3つの正確な挿入を可能にする。デバイスは、海馬の所定の領域に、インビボでネットワーク活動が非常に局所的に操作される。ガラスマイクロピペットによる局在4AP 注入は、海馬内の局在したスポットにおけるてんかん SLEs の誘導に役立ち、一方、新規のポリマーベースのμFIP プローブの助けを借りて、発作活性の制御は、ニューロンを記録することによって同時に達成されるデバイスの記録サイトでの電気的活動。海馬局所活性は、また、皮質および海馬における層特異的な方法で、マルチチャンネルのシリコンプローブで同時に監視されます。
最近発明されたμFIP プローブは、応用電界を使用して、イオン交換膜 (IEM) を介したマイクロ流体チャネルに保管され、周囲の組織に帯電した薬物を押し出すことによって動作します (図 1)。IEM は、1種類のイオン (カチオンまたはアニオン) のみを選択的に輸送するため、「オフ」状態での受動拡散と、周囲の組織からデバイスへの反対の荷電種の輸送の両方を制限する働きがあります。電界は、マイクロ流体チャネルの内部にあるソース電極と、デバイスの外部にあるターゲット電極 (この場合は、動物モデル上のヘッドスクリュー) の間に小さな電圧 (< 1 V) を印加することによって、オンデマンドで作成されます。薬物送達の速度は、供給元電極とターゲット極との間の印加電圧および測定電流に比例する。薬物送達の正確な同調は、μFIP の主要な利点の1つである。もう一つの重要な利点は、流体または圧力ベースの薬物送達システムと比較して、μFIP では、薬物がそのキャリア・ソリューションなしで IEM を越えて送達されるため、薬剤送達出口での圧力上昇はごくわずかであるということです。
ΜFIP が「オフ」の場合、GABA の受動的な漏出の少量があります, これは、SLEs を作用しないことが見出されました.ΜFIP は、我々が以前31を報告した従来の微細加工法に従ってオーダーメイドされています。
再発発作を防止する1つの方法は、最初の発作イベントの初めまたは前でのネットワーク放電の遮断であるため、てんかんの焦点に抑制性神経伝達物質 GABA を送達するための提示された方法は偉大な病巣性てんかんを有する患者における発作制御のための治療電位。GABA は内因性の基質であるので, 生理的濃度に変化せず内因性の神経特性を残します.GABA の低レベルのローカルアプリケーションは、阻害に自然に反応する細胞にのみ影響を与える, 脳深部刺激に反して、生理的阻害に類似した効果を引き起こすだけ, (DBS), すべての細胞を刺激することによって非特異的のアクションを持っています。、その環境における神経ネットワークの、励起および阻害の両方を含む混合応答を引き起こす。結論として、提案された方法は、DB よりも焼付き制御に対してより具体的なアプローチを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
てんかんの急性マウスモデルに新しい実験的プロトコルを開発することによって、SLEs は、てんかん焦点に移植されたμFIP の助けを借りて首尾よく制御することができた。時間的および空間的精度で GABA を送達する能力のおかげで、4AP 誘導 SLEs は、発作の発症時に制御された。てんかんの治療は、発作開始の場所でニューラルネットワークの放電の制御が達成された場合に理論的に可能であ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M.P. は、国際教育研究所によって管理されているウィテカー国際学者助成金からの資金を認めています。A.K. は、マリー・キュリー IEF (625372) によって後援されました。A.W. 欧州研究評議会 (ERC) の資金は、欧州連合 (eu) のホライゾン2020研究・イノベーションプログラム (助成契約第716867号) の下で認めています。A.W. はさらに、エクス・マルセイユ大学-A * MIDEX、フランスの「Investissements d’Avenir」プログラムのエクセレンス・イニシアティブを認めています。著者らは、Uguz Ilke 博士、Sahika Inal 博士、ヴィンチェンツォ Curto 博士、メアリー・ドナヒュー博士、マルク・フェロー、Zsófia Maglóczky が実りある議論に参加したことを認めている。
Materials
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Narishige | GJ-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 |
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