Halvledar sekvensering för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi
Summary
Här introducerar vi en halvledarsekvenserings metod för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi (PGT-A) med fördelarna med kort handläggningstid, låg kostnad och högt dataflöde.
Abstract
Kromosomalt aneuploidi, en av de främsta orsakerna som leder till embryonal utveckling gripande, implantation misslyckande, eller graviditet förlust, har väl dokumenterade i mänskliga embryon. Preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi (PGT-A) är ett genetiskt test som avsevärt förbättrar reproduktiva resultat genom att detektera kromosomavvikelser hos embryon. Nästa generations sekvensering (NGS) ger en hög genomströmning och kostnadseffektiv metod för genetisk analys och har visat klinisk tillämplighet i PGT-A. Här presenterar vi en snabb och låg kostnad halvledare sekvensering-baserade ngs metod för screening av aneuploidi i embryon. Det första steget i arbetsflödet är hela arvsmassan amplifiering (WGA) av biopsier embryo prov, följt av byggandet av sekvenserings bibliotek, och efterföljande sekvensering på halvledar systemet sekvensering. Generellt, för ett PGT-A-program, kan 24 prover laddas och sekvenseras på varje chip genererar 60 − 80 miljoner läsningar vid en genomsnittlig Läs längd på 150 bas par. Metoden ger ett förfinat protokoll för att utföra mallförstärkning och berikning av sekvenserings bibliotek, vilket gör PGT-A-detekteringen reproducerbar, hög genomströmning, kostnadseffektiv och tidsbesparande. Körtiden för denna halvledare Sequencer är endast 2 − 4 timmar, förkorta handläggningstiden från att ta emot prover till utfärdande rapporter i 5 dagar. Alla dessa fördelar gör denna analys till en idealisk metod för att upptäcka kromosomala aneuploidies från embryon och därmed underlätta dess breda tillämpning i PGT-A.
Introduction
Att välja god kvalitet livskraftiga embryon med normala kromosom kopienummer (euploid) för överföring i assisterad befruktning bidrar till att förbättra graviditetsutfall. Traditionellt används det väletablerade morfologiska klassificeringssystemet allmänt för embryoutvärdering på grund av dess enkla tillgänglighet och icke-invasiv natur. Det har emellertid visats att morfologisk bedömning endast kan ge begränsad information om embryokvalitet1 och implantationspotential2. En grundläggande orsak är dess oförmåga att utvärdera den kromosomala sammansättningen av embryona.
Kromosomalt aneuploidi (onormal kopia antal kromosomer) är en av de viktigaste orsakerna som leder till embryonal utveckling gripande, implantation misslyckande eller graviditet förlust. Förekomsten av aneuploidi har dokumenterats väl i mänskliga embryon och står för 60% − 70% i klyvning-steg embryon3,4 och 50% − 60% i blastocyster5. Detta har till viss del bidragit till flaskhalsen för att förbättra graviditets frekvensen för in vitro-fertilisering (IVF) behandling, som har hållit på runt 35% − 40%6,7. Därför, att välja euploid embryon för överföring tros vara fördelaktigt för att förbättra graviditetsutfall. För detta ändamål har preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi (PGT-A) vidareutvecklats för att undersöka embryots lönsamhet med hjälp av genetiska metoder. Det finns ett ökande antal randomiserade kontrollerade studier och kohortstudier som stöder den avgörande roll som PGT-A. Det har bevisats att tillämpningen av PGT-A minskar missfall frekvensen och ökar den kliniska dräktighets frekvensen och implantations frekvensen8, pågående graviditetsfrekvens och levande födelse kurs9.
Historiskt har olika metoder tillämpats i PGT-A, såsom fluorescens in situ hybridisering (fisk), jämförande genomisk hybridisering (CGH), array-CGH och Single nukleotid polymorfism (SNP)-microarray. Tidigare studier har visat att PGT-A för embryon från klyvning av fisk ger resultat som är dåligt överensstämmande med de som erhålls genom omfattande kromosom screening (CCS) av motsvarande blastocyster med 59273array-CGH eller SNP-microarray5927310. Dessa avvikelser kan hänföras till kromosomala mosaicism, fisk tekniska artefakter, eller embryonal självkorrigering av kromosom segregering fel under utveckling11. Det har allmänt erkänt att använda blastocyststadiet trophectoderm (te) biopsier för Array-baserade PGT-A såsom array-CGH eller SNP-microarray är effektivt för att identifiera kromosomala obalansen i embryon10,12. Nyligen ger Single-cell nästa generations sekvensering (ngs) en hög genomströmning och kostnadseffektiv metod för genetisk analys och har visat klinisk tillämplighet i PGT-a13,14,15, vilket gör det till en lovande alternativ till för närvarande tillgängliga metoder.
Här presenterar vi en snabb, robust och låg kostnad halvledare sekvensering-baserade ngs metod för screening av aneuploidi i mänskliga embryon. Den första steg om arbetsflödet är helhet genom förstärkning (WGA) om biopsier embryo prov, användande en enkel-cell WGA utrustning, följde efter vid byggningen av sekvenseringen bibliotek, och följande sekvenseringen på det Semiconductor sekvenseringen system.
Genom att detektera de H+ -joner som släpps ut från varje deoxyribonucleosid-trifosfatinkorporering under DNA-strandsyntesen, överför systemet de kemiska signalerna (pH-förändring) som fångas upp av halvledar elementen till direkt digital data , som ytterligare tolkas i DNA-sekvensinformation. Eliminerar kravet på dyra optisk detektering och komplexa sekvensering reaktioner, denna enkla sekvensering kemi minskar totala reagenskostnaden och förkortar sekvenseringen körtid i 2 − 4 timmar16. Ännu viktigare, baserat på tillverkarens prestandaspecifikationer, kan halvledar sekvensering plattformen generera upp till 15 GB sekvenserings data (beror på kvaliteten på biblioteket) per körning, vilket är betydligt högre än några av de andra sequencers producera endast runt 3 − 4 GB data (med 2 x 75 BP Läs längd)17. I kliniska tillämpningar av PGT-A kan denna plattform uppnå 24 prover per chip genererar upp till 80 000 000 läsningar17 och minst 1 000 000 unika läsningar av varje prov. Läs djupet kan säkerställa att varje prov har minst 0,05 x hela genomtäckning. Ovanstående fördelar med denna plattform gör det till en idealisk screeningmetod och därmed underlätta dess breda tillämpningar i PGT-A18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skiljer sig från andra sekvensering kemiska sammansättningar, Sequencer beskrivs här använder halvledare för detektion av nukleotider. Chippet i sig är en elektronisk apparat som detekterar vätejoner genom Polymerase-driven bas inkorporering17, vilket möjliggör en 2 − 4 h sekvenserings tid för protonprogrammet. Dessutom chip är en mikrobrunn chip som gör lokalisering av en målmolekyl, som skiljer sig från flödet cell sekvensering kemi av andra Sequencer providers. Detta protokoll …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av den allmänna forskningsfonden (Ref nr 14162417) från Hong Kong, National Natural Science Foundation i Kina (Ref nr 81860272), den stora forskningsplanen för Provincial Science and Technology Foundation i Guangxi (Ref nr. AB16380219), och China postdoktorala stiftelsen Grant (Ref nr. 2018M630993) från Kina.
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
- Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
- Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
- Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
- Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
- Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
- Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
- Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
- Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
- Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
- Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
- Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
- Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
- Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
- Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
- Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).
- Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).
